脂聯素對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1及膽固醇含量的影響及機制

郭曉紅邊云飛梁 斌白 瑞肖傳實

（1 山西醫科大學第一臨床醫學院心內科,山西 太原030001；2 山西醫科大學第二臨床醫學院心內科,山西 太原 030001）

脂聯素對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1及膽固醇含量的影響及機制

郭曉紅1邊云飛2梁 斌1白 瑞2肖傳實1

（1 山西醫科大學第一臨床醫學院心內科,山西 太原030001；2 山西醫科大學第二臨床醫學院心內科,山西 太原 030001）

目的探討脂聯素對RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1及膽固醇含量的影響及其可能的機制。方法體外培養RAW264.7細胞，加入20 mg/L氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）共同孵育48 h，將其誘導成泡沫細胞，加入不同濃度（0、1、5、10 μg/mL）的脂聯素干預24 h，RT-PCR測定ABCA1 mRNA的表達，高效液相色譜測定細胞內膽固醇含量。觀察脂聯素對泡沫細胞中ABCA1表達的影響。結果脂聯素顯著增加RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1 mRNA的表達（P＜0.05），并增加細胞內膽固醇含量，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。結論脂聯素可以增加巨噬源性泡沫細胞ABCA1轉錄水平，促進膽固醇流出，延緩AS的發生發展。

脂聯素；巨噬細胞源性泡沫細胞；ABCA1；膽固醇含量

動脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS）是一種影響動脈血管的綜合征。巨噬細胞攝入大量脂質形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化的一個早期重要特征,因此促使細胞內脂質流出即膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport,RCT）對防治AS具有重要作用。ATP結合盒轉運子A1（ATP binding cassettetransporter A1, ABCA1）是該過程中的一種重要轉運體,已有研究表明ABCA1在RCT過程中與載脂蛋白結合參與高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL）的形成,促使細胞內多余脂質流出并運輸至肝臟排出,在細胞膽固醇代謝中起著關鍵的調控作用,是RCT中的第一步也是關鍵的一步。脂聯素（Adiponectin,ADN）是脂肪細胞分泌的特異性細胞因子,它能抑制內皮細胞的炎性反應及血管平滑肌細胞增殖,同時抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉化[1-5],在肥胖相關疾病及多種心血管疾病中起保護作用。本研究旨在觀察脂聯素對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1表達的影響及膽固醇流出的作用,并進一步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞:巨噬細胞株（RAW264.7細胞）來自本實驗室。

1.2 主要材料、試劑及儀器:人重組脂聯素購自Sigma公司, RPMI1640培養基購自武漢博士德生物工程有限公司,胎牛血清購自杭州四季青公司,氧化低密度脂蛋白購自北京協和三友科技開發有限公司；RT-PCR逆轉錄試劑盒和RNAiso購自TaKaRa公司；ABCA1引物購自Abcam公司,β-actin（內參）購自上海生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 泡沫細胞的制備及鑒定[6,7]:泡沫細胞模型的建立參照文獻[9,10]進行:用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基,于37 ℃、5%CO2培養箱中靜置培養。待細胞長到80%滿的時候,進行傳代,傳至4-5代時將生長良好的RAW 264.7細胞以2×104個/L的密度接種于6孔培養板,培養24 h,細胞貼壁后棄細胞液,加入20 mg/Lox-LDL共培養48 h建立泡沫細胞模型。用油紅O染色15 min,再用60%油紅O異丙醇清洗,再立即用PBS清洗3遍,顯微鏡下觀察泡沫細胞形態,顯微鏡下可見胞內亮紅色脂滴即為泡沫細胞。

1.3.2 實驗分組:實驗分為4組:①對照組；②加入1 μg/mL脂聯素組；③加入5 μg/mL脂聯素組；④加入10 μg/mL脂聯素組,干預24 h。每組設3個復孔。

1.3.3 RT-PCR法檢測細胞中ABCA1 mRNA的表達:采用Trizol法提取各組細胞總mRNA,合成cDNA第一鏈,以其為模板進行擴增,以β-actin為內參,引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。ABCA1上游引物序列為:TGGATGGATTAGATTGGACTG,下游引物序列為TGTTGATGAGCCTGACTTC,bp為201,β-actin上游引物序列為GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT,下游引物序列為AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT,bp為184。ABCA1 反應條件為:94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 延伸30 s,共35個循環；72 ℃再延伸5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并用Quantitity One凝膠圖像分析系統分析,以目的基因與β-actin基因區帶面積積分灰度值的比值表示目的基因的相對表達量。試驗重復3次。

1.3.4 細胞內膽固醇含量的測定:酶法結合高效液相色譜法測定各組細胞內膽固醇含量。RIPA裂解液裂解細胞,使蛋白含量在100～200 mg/L。取2份各100 μL,采用酶法結合高效液相色譜法測定各組細胞內總膽固醇（total cho-lesterol,TC）和游離膽固醇（free cholesterol,FC）,TC與FC的差值為膽固醇酯（cholesterol ester,CE）,膽固醇酯與總膽固醇的比值（CE/ TC）,實驗重復2次。

1.3.5 統計學分析:應用SPSS13.0軟件進行統計分析,實驗數據以均數±標準差表示,組間比較采用析因設計資料的方差分析, P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 泡沫細胞的鑒定:細胞吞入脂質形成的泡沫細胞經油紅O染色,鏡下可見細胞內脂質染成亮紅色,見圖1、圖2。

2.2 細胞中ABCA1 mRNA的表達:RT-PCR結果顯示,與對照組相比,不同濃度脂聯素干預組ABCA1 mRNA的表達均明顯升高,且呈濃度依賴性,見表1、圖3。

2.3 不同濃度脂聯素對泡沫細胞內膽固醇含量的影響:檢測結果顯示,與對照組比較,不同濃度的脂聯素干預組膽固醇含量,均明顯增高,且呈濃度依賴性,見表2。

圖1 RAW264.7巨噬細胞

圖2 RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞。圖中箭頭所指即為泡沫細胞

圖3 RT-PCR測定RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1基因mRNA的表達水平

1為DNAMaker,2為對照組,3為β-actin（184bp）,4為1 μg/mL脂聯素組,5為5 μg/mL脂聯素組,6為10 μg/mL脂聯素組。

表1 各組RAW264.7源性泡沫細胞ABCA1mRNA的表達水平（相對表達量，，n=3）

表1 各組RAW264.7源性泡沫細胞ABCA1mRNA的表達水平（相對表達量，，n=3）

注：與同時間點對照組比較，aP＜0.05；與同時間點1 μg/mL脂聯素組比較，bP＜0.05；與同時間點5 μg/mL脂聯素組比較，cP＜0.05

3 討 論

膽固醇逆轉運（RCT）是指膽固醇從外周細胞中流出[11-16],與載脂蛋白A-Ⅰ（ApoA-I）結合,形成HDL,轉運至肝臟排出的過程,是體內抗動脈粥樣硬化（AS）的生理性保護機制,也是防止泡沫細胞形成的重要途徑。ABCA1是ATP結合盒轉運子超家族的成員,是RCT過程中的一種重要轉運蛋白,介導細胞內膽固醇流出,是起始步驟的關鍵。脂聯素在心血管疾病中起保護作用,大量研究顯示脂聯素具有廣泛的抗AS作用,能抑制巨噬細胞清道夫受體的表達,促使細胞內膽固醇外流。研究發現,冠狀動脈病變的嚴重程度與脂聯素水平呈負相關。還有研究提示,脂聯素可能對心肌肥厚具有抑制作用。在抗AS中,脂聯素可抑制血管平滑肌細胞的增殖、遷移,促使巨噬泡沫細胞內膽固醇流出,抑制動脈斑塊形成及穩定斑塊。但脂聯素促使細胞內膽固醇流出上調ABCA1表達,其機制尚不明確[17-19]。

表2 各組RAW264.7源性泡沫細胞內膽固醇含量的表達量

表2 各組RAW264.7源性泡沫細胞內膽固醇含量的表達量

注：與同時間點對照組比較，aP＜0.05；與同時間點1 μg/mL脂聯素組比較，bP＜0.05；與同時間點5 μg/mL脂聯素組比較，cP＜0.05

本實驗結果顯示,脂聯素能呈濃度依賴性地上調巨噬細胞源性泡沫細胞中ABCA1基因的轉錄水平,提示脂聯素可能通過上調ABCA1的表達[20],增加細胞內膽固醇流出率,促進膽固醇外流,從而延緩AS的發生、發展。

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Adiponectin Effects on Macrophage Derived Foam Cells and Cholesterol Content and Mechanism of ABCA1

GUO Xiao-hong1, BIAN Yun-fei2, LIANG Bin2, BAI Rui2, XIAO Chuan-shi1
(1 Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2 Department of Cardiology, The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

ObjectiveEffects of adiponectin on RAW264.7 macrophage derived foam cells and cholesterol content to ABCA1) objective and its possible mechanisms.MethodsRAW264.7 cells cultured in vitro, joined the 20mg/L oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) were incubated for 48 h, the induced into foam cells, with different concentrations (0,1,5,10 μg/mL) of adiponectin 24h expression of RT-PCR ABCA1 mRNA, determination, HPLC determination of intracellular cholesterol content. To observe the effects of adiponectin on the expression of ABCA1 in foam cells.ResultsThe expression of adiponectin was significantly increased in RAW264.7 macrophage derived foam cells in ABCA1 mRNA (P＜0.05), and increased cellular cholesterol content, in a dose-dependent manner (P＜0.05).ConclusionAdiponectin can increase the macrophage derived foam cell ABCA1 transcription level, promote cholesterol efflux, delay the occurrence and development of AS.

Adiponectin; Macrophage derived foam cells; ABCA1; Cholesterol

R54

B

1671-8194（2014）25-0046-03