越南安息香大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育

吳 君，李因剛，柳新紅*，黃有軍，石從廣，陳慶標，張少偉

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；3. 浙江省建德市新安江林場，浙江 建德 311600）

越南安息香大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育

吳 君1，李因剛1，柳新紅1*，黃有軍2，石從廣1，陳慶標3，張少偉3

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；3. 浙江省建德市新安江林場，浙江 建德 311600）

利用常規(guī)石蠟切片技術(shù)對越南安息香（Styrax tonkinensis）大小孢子發(fā)生及雌雄配子體的發(fā)育過程進行顯微觀察，結(jié)果表明：越南安息香花藥4室，花藥壁由內(nèi)向外分別為絨氈層、中層、藥室內(nèi)壁和表皮；花藥壁發(fā)育屬于基本型，絨氈層屬于腺質(zhì)型；小孢子母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成左右對稱型四分體，胞質(zhì)分裂為同時型，成熟花粉粒為2-細胞型，具有3個萌發(fā)孔；子房3室，胚珠多數(shù)，倒生，具雙珠被，厚珠心，中軸胎座；大孢子母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成線型四分體，3個大孢子退化，合點端的1個發(fā)育成大孢子，胚囊發(fā)育為蓼型；雄蕊發(fā)育早于雌蕊，開花后雌雄蕊趨于同熟。

越南安息香；大孢子；小孢子；雄配子體；雌配子體

越南安息香（Styrax tonkinensis）俗稱“東京野茉莉”，屬安息香科安息香屬落葉喬木，為熱帶、亞熱帶陽性樹種。總狀花序，花白色成串，清香，花期4－6月；果實近球形，果序下垂，果期8－10月[1～3]。越南安息香是集藥用、材用、油用和觀賞等多種價值于一身的樹種[4～8]，近幾年引起了研究者的廣泛重視，并從不同角度進行了大量研究[9～12]，但有關(guān)其生殖生物學(xué)，特別是生殖生長發(fā)育方面的基礎(chǔ)性研究未見報道。本研究以江西吉水種源地的越南安息花芽為試驗材料，對其大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育進行了觀察研究，為越南安息香生殖和發(fā)育生物學(xué)、遺傳育種提供相關(guān)理論基礎(chǔ)，并為安息香科植物的胚胎學(xué)研究提供新資料。

1 材料與方法

1.1 材料與取樣

材料為浙江省林業(yè)科學(xué)研究院苗圃內(nèi)4年生越南安息香試驗林（海拔31 m，120°01′ 29″ E，30°13′ 08″ N ），種源地為江西吉水。采樣時間段為2012年4月11日（出現(xiàn)花芽）至5月13日（花開放），2 ～ 3 d采樣1次。在林內(nèi)隨機選取5株健康植株進行采樣，于樹冠東南西北4個方向各采若干個花芽。采樣完畢后立即帶回實驗室，洗凈后放入70% FAA固定液中備用，常溫條件下保存。

1.2 制樣方法

用常規(guī)的石蠟切片法制片，LeciaRM2265輪轉(zhuǎn)式自動切片機連續(xù)切片，厚度為8 ～ 12 μm，番紅—固綠對染法染色，中性樹膠封片，顯微鏡Olympus BX60觀察組織切片，Olympus digital camera型相機拍照。試驗于2012年8－11月在浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育

2.1.1 花藥壁發(fā)育 越南安息香為圓錐花序，或漸縮小成總狀花序（圖1-1），每朵花具有4 ～ 10枚花藥，多10枚，同大部分被子植物一樣具有4個花粉囊（圖1-2）。4月中旬，花芽開始萌動，此時形成的小花藥是由一群有高度分裂能力的細胞組成。花藥四個角隅分裂速度快，并形成體積大、細胞質(zhì)濃、核大的孢原細胞，橫切面上為四棱形，它的最外面分化出一層表皮（圖1-3）。孢原細胞比其他的細胞大且分裂快，輻射向增大，經(jīng)一次平周分裂形成初生周緣細胞（外層）與初生造孢細胞（內(nèi)層）。初生周緣細胞再進行平周和垂周分裂，產(chǎn)生2層次生周緣層，靠近表皮的一層次生周緣細胞分化形成藥室內(nèi)壁和中層細胞，內(nèi)側(cè)一層次生周緣細胞分化形成中層和絨氈層細胞。至此，花藥壁分化完成，從外向內(nèi)依次由表皮細胞（1層）、藥室內(nèi)壁細胞（1層）、中層（2層）細胞及絨氈層細胞（圖1-4）。根據(jù)Davis對被子植物花藥壁形成方式的劃分，其花藥壁的發(fā)育屬于基本型[13]。

隨著小孢子母細胞減數(shù)分裂及花粉粒的形成，花藥壁發(fā)生了一系列變化。越南安息香花粉囊表皮宿存，隨著花藥的發(fā)育而體積增大。藥室內(nèi)壁不發(fā)達，退化（圖1-5），在整個花藥發(fā)育過程中未見藥室內(nèi)壁加厚形成纖維層。中層壁細胞在花粉母細胞減數(shù)分裂時逐漸解體而被吸收。絨氈層在整個發(fā)育過程中原生質(zhì)體始終保持在原位。在花粉母細胞減數(shù)分裂期間，絨氈層體積逐漸增大，細胞質(zhì)進一步變濃，細胞近方形，排列整齊（圖1-6）；四分體時，有解體現(xiàn)象（圖1-7）；單細胞時期，絨氈層細胞解體明顯（圖1-8）；到花粉成熟，絨氈層完全解體（圖1-9）。可以看出，其細胞是原位解體，屬于腺質(zhì)絨氈層。

2.1.2 小孢子的發(fā)生 初生造孢細胞不斷進行減數(shù)分裂，發(fā)育形成體積大、細胞核大的小孢子母細胞（圖1-10）。小孢子母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂Ⅰ后，形成2個細胞核且不形成細胞壁（圖1-11、圖1-12）。減數(shù)分裂Ⅱ后，形成四分體，4個子細胞共同處于一個胼胝壁內(nèi)（圖1-13、圖1-14、圖1-15、圖1-16），其胞質(zhì)分裂為同時型。

2.1.3 雄配子體發(fā)育 隨著胼胝質(zhì)壁溶解，小孢子彼此分開，被釋放到花藥腔中。剛從四分體中分離的小孢子細胞壁薄，細胞質(zhì)濃，細胞核大且位于細胞中央（圖1-18）。隨后小孢子細胞質(zhì)形成一個中央大液泡，細胞核被擠到細胞邊緣，花粉壁加厚，逐漸成為單核靠邊期小孢子（圖1-19）。此后，小孢子進行不均等胞質(zhì)分裂，形成的大的營養(yǎng)細胞核和小的生殖細胞（圖1-20）。隨著雄配子體的發(fā)育，生殖細胞游離在營養(yǎng)細胞之中。成熟花粉為2-細胞型，具有3個萌發(fā)孔（圖1-21）。

2.2 大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育

2.2.1 胚珠發(fā)育 4月底越南安息香花芽形成雌蕊原基后，生長分化，形成柱頭、花柱及子房。柱頭三裂（圖

圖1 小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育

2-1），為濕型柱頭；開放型花柱（圖2-2），花柱中有花柱道。子房3室，胚珠多枚（圖2-3），胚珠是由胎座上的胚珠原基發(fā)育而成的，子房內(nèi)表皮下的一些細胞產(chǎn)生一團具有強裂分裂能力的細胞突起，稱為胚珠原基。（圖2-4）。原基向上生長，前端發(fā)育成珠心，基部發(fā)育成珠柄，與胎座相連，胚珠生長時，珠柄和其他部分的生長速度并不一致，因此著生方位不同。越南安息香的胚珠為倒生胚珠，整個胚珠180°扭轉(zhuǎn)，呈倒懸狀。

2.2.2 大孢子發(fā)生 子房發(fā)育早期，其內(nèi)室中央表皮出現(xiàn)一微突起，即為胚珠原基（圖2-4）。隨后珠心表皮下出現(xiàn)1個體積大、細胞質(zhì)濃且核大的孢原細胞（圖2-5）。孢原細胞進行平周分裂產(chǎn)生1個周緣細胞和1個造孢細胞（圖2-6）。造孢細胞擴大直接發(fā)育成大孢子母細胞。大孢子母細胞核大、細胞質(zhì)濃厚，進行減數(shù)分裂。經(jīng)2次減數(shù)分裂后產(chǎn)生4個單倍體大孢子（圖2-7），近珠孔的3個細胞退化，合點端的一個發(fā)育成功能大孢子（圖2-8）。

2.2.3 雌配子體發(fā)育 雌配子體是由功能性大孢子發(fā)育而來的。合點端的功能性大孢子繼續(xù)發(fā)育，形成單核胚囊，單核胚囊體積繼續(xù)增大。單核胚囊經(jīng)過第一次有絲分裂，形成二核胚囊（圖2-9），再經(jīng)過第二次有絲分裂形成四核胚囊（圖2-10），繼而經(jīng)過最后一次有絲分裂形成八核胚囊。在成熟的胚囊中可見1個卵細胞和2個助細胞呈品字形排列，三者合一，稱為卵器。2個助細胞細胞質(zhì)濃厚，相互排列緊密。在胚囊中央可見中央細胞的2個極核相互融合，形成1個大的次生核。合點端的三核為反足核（圖2-11、圖2-12、圖2-13）。綜上所述，可見越南安息香的胚囊發(fā)育類型屬于蓼型。

圖2 大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育

2.3 雌雄蕊發(fā)育時間段對比 在越南安息香雌、雄蕊發(fā)育過程中，雄蕊發(fā)育較早，而雌蕊發(fā)育相對較遲緩，小孢子母細胞減數(shù)分裂時期，雌蕊胚珠原基才處于發(fā)育階段。小孢子四分體時，大孢子母細胞才形成。雌蕊后期發(fā)育加快，與雄蕊達到同熟，見表 1。由此可見，越南安息香的雌雄蕊發(fā)育并不同步。

表1 雌雄蕊發(fā)育時期

3 結(jié)論與討論

植物的有性生殖對產(chǎn)生有機后代和維持物種延續(xù)起絕對性的作用[14]。越南安息香花藥壁的發(fā)育屬于基本型。從外向內(nèi)依次由表皮細胞（1層）、藥室內(nèi)壁細胞（1層）、中層（2層）細胞及絨氈層細胞組成。相關(guān)研究中，北柴胡（Bupleurum chinenes）、阿月渾子（Pistacia vera）、楸（Catalpa bungei）[15～17]等大多物種在花粉壁發(fā)育時，藥室內(nèi)壁會加厚，最后形成纖維層。而越南安息香的藥室內(nèi)壁在整個花藥發(fā)育過程中未見加厚形成纖維層，而是到花粉成熟時退化。這種現(xiàn)象在紅直獐牙菜（Swertia erythrosticta），川東獐牙菜（Swertia davidii）[18～19]中已有報道。這可能是由于藥室內(nèi)壁不發(fā)達造成的，致使藥室內(nèi)壁細胞在花粉發(fā)育過程中被完全吸收。越南安息香小孢子母細胞在減數(shù)分裂中胞質(zhì)分裂為同時型，產(chǎn)生左右對稱四分體；成熟花粉為二細胞型，有3個萌發(fā)孔。

越南安息香柱頭三裂，濕型柱頭，花柱中有花柱道。子房3室，胚珠多枚，倒生胚珠；雙珠被，厚珠心。成熟的胚囊中2個助細胞和1個卵細胞呈品字形排列構(gòu)成卵器，中央細胞的2個極核在胚囊中央融合，形成1個大的次生核，合點端的三核為反足核。胚囊發(fā)育屬于蓼型。山礬科與安息香科在親緣關(guān)系上比較密切，研究表明，華山礬（Symplocos chinens）[20]的胚囊發(fā)育也屬于蓼型，這與越南安息香的胚囊發(fā)育相一致。在越南安息香雌、雄蕊發(fā)育過程中，雄蕊發(fā)育較早，而雌蕊發(fā)育相對較遲緩，雌蕊后期發(fā)育速度加快，與雄蕊達到同熟。本研究報道了越南安息香的雌雄配子體發(fā)育及大小孢子形成，在整個發(fā)育過程中未見明顯的異常現(xiàn)象，可為今后系統(tǒng)分類提供有意義的胚胎學(xué)證據(jù)。

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Megasporogenesis, Microsporogenesis and Development of Male and Female Gametophytes in Styrax tonkinensis

WU Jun1，LI Yin-gang1，LIU Xin-hong1*，HUANG You-jun2，SHI Cong-guang1，CHEN Qing-biao3，ZHANG Shao-wei3
（1. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 2. Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 3. Jiande Xin’anjiang Forestry Farm of Zhejiang, Jiande 311600, China）

The megasporogensis, microsporogenesis and development of male and female gametophytes of Styrax tonkinensis were observed by paraffin section technique. The results showed that anthers is 4-sporangiate, and the wall of anther consists of tapetum, middle layers, endothecium and epidermis from inside to out. The development of anther has classified into basic and the tapetum cell is glandular tapetum. The microspore mother cells give rise to isobilateral tetrads by meiosis. Cytokinesis is simultaneous. Mature pollen grain is 2-cell type with three germ pores, with ovaryis trilocular. The ovule is anatropous, bitegmious, crassinucellate axile placenta. The chalazal megaspore in a linear tetrad becomes megaspore. The development of embryo sacs belonges to polygonum type and the stamen was earlier than that of pistil, they synchronized after blossom.

Styrax tonkinensis; megasporogensis; microsporogenesis; male gametophytes; femalegametophytes

S718.43

A

1001-3776（2014）01-0047-05

2013-07-09；

2013-11-10

浙江省省院合作林業(yè)科技項目（2010SY05）；浙江省創(chuàng)新團隊建設(shè)與人才培養(yǎng)項目（2010F20014）；浙江省重大科技專項重點項目（2008C12019）

吳君（1988－），女，浙江上虞人，碩士生，從事觀賞植物資源研究；*通訊作者。