他莫昔芬體外促進HepG2細胞脂肪變性觀察*

趙 斐，謝 萍，姜佳麗，張令強，安 威，展玉濤

·酒精性肝病·

他莫昔芬體外促進HepG2細胞脂肪變性觀察*

趙 斐，謝 萍，姜佳麗，張令強，安 威，展玉濤

目的研究他莫昔芬（TAM）對體外培養的HepG2細胞脂肪變性以及脂類代謝調控關鍵因子表達的影響。方法應用油酸（50 μmol/L）處理HepG2細胞，誘導細胞脂肪變性體外模型，同時給予不同濃度的TAM（5～20 μmol/L）干預72 h；采用油紅O染色和甘油三酯含量測定檢測HepG2細胞內脂質聚集情況；應用蛋白印跡法檢測固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS）、硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）、肉酯軟脂酰基轉移酶（CPT1）和微粒體甘油三酯轉移蛋白（MTP）的表達；采用細胞活性檢測試劑盒測定細胞活性。結果在干預72 h后，模型組細胞內甘油三酯含量為（16.53±0.17）mg/100 mg蛋白質，在5 μmol/L TAM處理細胞內甘油三酯含量為（17.77±0.05）mg/100mg蛋白質，與模型組無顯著性差異，但在10 μmol/L和20 μmol/L TAM處理組較模型組分別增加了31%[（21.57±0.16）mg/100 mg蛋白質]和44%[（23.82±0.44）mg/100 mg蛋白質]，（P＜0.05）；TAM上調細胞內SREBP-1c、FAS、SCD和MTP蛋白表達，但并不改變CPT1蛋白表達；TAM在5～20 μmol/L范圍內不影響HepG2細胞活性。結論TAM可促進油酸誘導的HepG2細胞脂肪變性，其主要機制可能是通過上調SREBP-1c及其下游基因，如FAS和SCD的表達而增加了脂肪酸的合成。

HepG2細胞；他莫昔芬；脂肪變；甘油三酯；脂肪酸合成

乳腺癌是世界上女性最常見的惡性腫瘤[1]，主要分為雌激素受體陽性（約占75%）和雌激素受體陰性乳腺癌兩種類型[2]。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是治療雌激素受體陽性乳腺癌的“金標準”藥物[3]，在臨床上應用十分廣泛。然而，長期使用TAM會產生一系列的副作用，其中引起非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）最常見[4]。有資料顯示，TAM治療的女性乳腺癌患者有43%在治療的前2年內出現脂肪肝或脂肪性肝炎，尤其是一些超重的女性，甚至會出現肝硬化[5]。因此，明確TAM促進NAFLD發生的機制，對于防治TAM引起的NAFLD具有重要意義。目前，一些針對TAM引起NAFLD機制的研究主要是在動物實驗，而且結果不一。在本研究中，我們運用體外肝細胞脂肪變性模型直接探索了TAM對HepG2細胞脂肪變性的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人肝癌細胞株HepG2細胞（北京地壇醫院傳染病學研究所惠贈）；DMEM培養基和胎牛血清（Hyclone公司）；0.25%胰酶（Gibco公司）；TAM、油紅O和二甲基亞砜（Sigma公司）；甘油三酯檢測試劑盒和蛋白定量檢測試劑盒（Bioassay公司）；細胞活性檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8，日本同仁化學研究所）；抗固醇調節元件結合蛋白-1c（sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c）抗體、抗硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）抗體、抗肉酯軟脂酰基轉移酶（carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）抗體和抗微粒體甘油三酯轉移蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTP）抗體（Abcam公司）；抗脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）抗體和相關二抗（Santa Cruz公司）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（MBL公司）。

1.2 細胞脂肪變性模型的建立和TAM干預實驗取HepG2細胞，以含10%胎牛血清的DMEM培養基培養于37℃，5%CO2的細胞培養箱中。選擇終濃度為50μM的油酸（oleic acid，OA）培養72 h，以誘導細胞脂肪變性。設模型組和TAM干預組。根據實驗的需要，將細胞鋪于不同規格的細胞培養板或培養瓶中，在接種細胞24 h后，將正常完全培養基更換為高脂培養基（OA=50 μM），同時分別加入終濃度為0、5、10和20 μmol/L的TAM，培養72 h，收集細胞。

1.3 細胞內脂滴形成的觀察將細胞接種于6孔板內，同時放入小蓋玻片，制作細胞爬片，按上述方法分組處理細胞72 h后，采用油紅O染色，觀察細胞內的脂滴形成情況。以PBS沖洗細胞3次，10%中性甲醛固定5 min，加油紅O染液浸染15 min，60%異丙醇洗去多余染液，蘇木素染核1min，蒸餾水洗去多余的染色液，甘油明膠封片。在顯微鏡下觀察細胞內的脂滴情況，攝像。

1.4 細胞內甘油三酯質量分數測定將細胞培養于培養瓶中，按上述方法分組處理72h，收集細胞，用胰酶消化后離心，取細胞沉淀，PBS洗滌2～3次，加入等滲緩沖液400μL，超聲破碎細胞，取破碎好的勻漿液進行測定。取10μL標準品和樣品，分別放入96孔板，每組設3個平行孔，在各孔中加入100μL配制好的工作試劑，室溫孵育30 min，于570 nm讀取吸光度。根據標準曲線，計算每組甘油三酯質量分數，同時用蛋白質定量試劑盒測定各組細胞樣品中蛋白質質量分數，對結果進行標準化（mg/100mg蛋白質）。

1.5 脂類代謝關鍵調節因子蛋白表達的檢測采用免疫印跡法，收集細胞，加入適量的細胞裂解液及等量的2×Sample buffer混和，100℃沸水煮10 min，進行SDS-PAGE電泳。切下含目的條帶的SDS變性膠，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，進行電轉移，隨后在含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中封閉60 min。封閉后，加一抗孵育，4℃過夜，再用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。然后加耦聯HRP的二抗，室溫孵育1 h，最后經TBST洗膜3次，加入底物化學發光試劑，于暗室中進行X光片曝光顯影。

1.6 細胞活性檢測以CCK-8法檢測細胞活性，即將密度為1×105/mL細胞以100μL/孔接種于96孔板，每組設6個平行孔，按上述方法分組處理72 h，更換培養基為包含10μL CCK-8溶液的完全培養基，于37℃，5%CO2的細胞培養箱中孵育1 h，在450 nm讀取吸光度。數據以A450（他莫昔芬干預組+模型組）-A450（空白）表示。

2 結果

2.1 TAM促進OA誘導的細胞內脂肪形成在光學顯微鏡下觀察，可見HepG2細胞為不規則或卵圓形，胞漿內可見散在的紅色脂滴，經不同濃度的TAM（0、5、10和20μmol/L）干預后，可見胞漿內紅色脂滴數目增加，并且隨藥物濃度的增加呈現劑量依賴效應（圖1～4）。

圖1 模型組HepG2細胞內脂滴形成（油紅O染色，400×）

圖2 5μM TAM干預72 h后HepG2細胞內脂滴形成（油紅O染色，400×）

圖3 10μM TAM干預72 h后HepG2細胞內脂滴形成（油紅O染色，400×）

圖4 20μM TAM干預72 h后HepG2細胞內脂滴形成（油紅O染色，400×）

2.2 TAM增加細胞內甘油三酯質量分數在5μM TAM干預72 h后，HepG2細胞內甘油三酯質量分數（17.77±0.05）mg/100mg蛋白質較模型組（16.53±0.17）mg/100mg蛋白質略有增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）。在10μM～20μM TAM干預72 h后，甘油三酯質量分數較模型組分別增加了31%和44%[分別為（21.57±0.16）mg/100 mg蛋白質和（23.82±0.44）mg/ 100 mg蛋白質]，與模型組比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 TAM對甘油三酯代謝相關分子蛋白表達的調節作用SREBP-1c是調控肝臟脂肪酸合成的重要轉錄因子，可促進一系列脂類合成相關基因的表達，包括FAS和SCD等。蛋白印跡檢測結果顯示（圖5），TAM干預上調了SREBP-1c的表達，并且作用呈劑量依賴性。與此相一致的是，FAS和SCD蛋白表達增加也呈現相似的效應。同時，CPT1表達無明顯變化，而MTP表達上調。

圖5 不同濃度TAM干預后HepG2細胞SREBP-1c、FAS、SCD、CPT1和MTP蛋白表達

2.4 TAM對HepG2細胞活性的影響經5～20μM TAM干預后HepG2細胞活性與模型組相比差異無統計學意義（P＞0.05），表明我們所使用濃度范圍內的TAM干預對HepG2細胞的數量無明顯影響，排除了各組甘油三酯質量分數的差異是由細胞數量不同所致的可能性。然而，我們還觀察到更高濃度（大于20μM）的TAM可對HepG2細胞產生毒性作用，抑制其增殖（數據未列出）。

3 討論

TAM是一種非類固醇類雌激素受體拮抗劑，作為乳腺癌內分泌治療金標準的藥物應用于臨床已超過30年，但長期服用TAM也會產生一系列的毒副作用，包括低血糖癥、高甘油三酯血癥、血漿膽固醇水平改變以及一些肝臟疾病[4]。臨床研究表明TAM治療與NAFLD的發生有關[6]，動物實驗也進一步證實TAM可誘發NAFLD[7]。在本研究中，我們通過體外實驗證實了TAM可促進細胞脂肪變性。

NAFLD以肝細胞內脂肪即甘油三酯積聚為主要特征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎及其相關的肝硬化。關于NAFLD發病機制，目前國內外普遍認可的是Day和James提出的“二次打擊”學說[8]。固醇調節元件結合蛋白屬于核轉錄因子家族，有三個成員：即SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2[9]。SREBP-1c是調控肝臟脂肪酸合成的主要亞型（90%）[10]。SREBP-1c可激活脂肪酸合成的關鍵酶基因，包括ATP檸檬酸裂解酶、乙酰輔酶A羧化酶、FAS、SCD及甘油-3-磷酸酰基轉移酶等[11]。目前，關于TAM對動物肝臟SREBP-1c及其下游基因影響的研究，其結果不同。Lelliott等發現在TAM處理過的大鼠肝臟SREBP1 mRNA水平無變化，而FAS和SCD mRNA水平下降[7]。經TAM處理后FAS mRNA水平上升200%，但蛋白表達未改變，而SCD mRNA水平下降60%[5]。Gudbrandsen等認為TAM并不影響大鼠肝臟SCD活性及其mRNA水平，但TAM可以使FAS活性下降，并且下調FAS mRNA水平[12]。我們研究發現，TAM可以增加HepG2細胞SREBP-1c、FAS和SCD蛋白表達。我們推測，TAM可能是通過提高SREBP-1c轉錄活性，進一步上調其下游脂肪生成基因的表達，從而導致細胞內甘油三酯積聚。

TAM增加肝細胞內脂質積累與線粒體脂肪酸β氧化受阻有關嗎？CPT1是線粒體脂肪酸β氧化的限速酶[13]。Cole等認為TAM對小鼠肝臟CPT1 mRNA水平無顯著影響[5]。TAM不會改變肝臟β氧化降解物乙酰輔酶A和丙酰輔酶A水平[12]。在目前的體外研究中，我們也沒有發現TAM對于HepG2細胞CPT1蛋白表達有影響。因此，TAM可能不是通過抑制線粒體脂肪酸β氧化加速肝細胞中甘油三酯積聚的。

有研究顯示，TAM處理后肝臟甘油三酯水平升高并伴隨著血清甘油三酯水平下降[12]。脂肪酸能夠通過酯化作用轉變成甘油三酯，以VIDL的形式分泌出細胞。載脂蛋白B100是VLDL最重要的蛋白組分。MTP是VLDL組裝和分泌的關鍵因子，它可結合甘油三酯等多種脂質分子，并將這些脂質呈遞給載脂蛋白B100[14]。在本研究中，我們發現TAM不會抑制HepG2細胞MTP表達。因此，我們認為TAM引起的HepG2細胞甘油三酯積聚可能與VLDL的組裝和分泌無關。相反的是，我們觀察到TAM可以增加HepG2細胞中MTP蛋白表達，可能是由于TAM引起甘油三酯積聚，通過反饋調節機制刺激了MTP的表達。

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（收稿：2013-10-15）

（校對：陳從新）

Tamoxifenpromotes lipidaccumulationinHepG2 cells invitro

Zhao Fei，Xie Ping，Jiang Jiali，et al.
Department of Gastroenterology，Tongren Hospital，Capital Medical University，Beijing 100730，China

ObjectiveTo investigate the effect of tamoxifen（TAM）on steatosis in HepG2 cells in vitro and on the expression of key regulators involved in lipid metabolism in the cells.MethodsA cell model of steatosis was induced in HepG2 cells in vitro with oleic acid（OA）at 50 μmol/L；HepG2 cells were then subjected to different concentrations of TAM（5 to 20 μmol/L）at the presence of OA for 72 h；Intracellular lipid accumulation was assessed by oil red O staining and measurement of triglyceride；The expression of sterol regulatory elementbinding protein-1c（SREBP-1c），fatty acid synthase（FAS），steroyl-CoA desaturase（SCD），carnitine palmitoyltransferase 1（CPT1）and mitochondrial trifunctional protein（MTP）was determined by Western blot；Cell viability was detected by cell counting Kit-8 assay.ResultsAfter incubation for 72 h，the intracellular triglyceride in control group was（16.53±0.17）mg/100 mg protein，similar to that of cells treated with 5μmol/L TAM，however，the intracellular triglyceride was increased by 31%[（21.57±0.16）mg/100 mg protein]and 44%[（23.82±0.44）mg/100 mg protein]in cells treated with 10 μmol/L and 20 μmol/L of TAM，respectively（P＜0.05）；TAM treatment（5 to 10 μmol/L）significantly increased the expression of SREBP-1c，FAS，SCD and MTP without affecting the expression of carnitine palmitoyltransferase 1（CPT1）in HepG2 cells；TAM did not affect HepG2 viability.ConclusionsTAM promotes OA-induced cell steatosis，probably by up-regulation of SREBP-1c，FAS and SCD，thus increases fatty acid synthesis in the cells.

HepG 2 cells；Tamoxifen；Steatosis；Triglyceride；Fatty acid synthesis

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.009

肝臟保護與再生調節北京市重點實驗室課題（2013年資助）

100730北京市首都醫科大學附屬北京同仁醫院消化科（趙斐，姜佳麗，展玉濤）；軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所（謝萍，張令強）；首都醫科大學基礎醫學院細胞生物學系（安威）

趙斐，女，26歲，碩士研究生。主要從事非酒精性脂肪性肝病的發病機制研究。E-mail：fayefly.future@163.com

展玉濤，E-mail：yutaozhan@263.net