慢性HBV攜帶者肝組織Fas和Fas配體表達變化及其意義

代雪楓，馬 勇，徐長江，王 莉

·病毒性肝炎·

慢性HBV攜帶者肝組織Fas和Fas配體表達變化及其意義

代雪楓，馬 勇，徐長江，王 莉

目的觀察慢性HBV攜帶者（chronic asymptomatic HBV carrier，ASC）肝組織Fas和Fas配體（FasL）的表達和血清可溶性Fas（sFas）水平的變化。方法對120例ASC行肝穿刺，采用免疫組織化學法檢測肝組織Fas和FasL表達，采用ELISA法檢測血清sFas水平。結果120例ASC肝組織完全正常者僅占11%，輕度肝炎占59%，而中、重度肝炎占30%；表現正常的肝組織無Fas和FasL表達，輕度肝炎肝組織多無表達或僅限于界面炎癥區的肝細胞及淋巴細胞陽性表達，而中、重度肝炎肝組織Fas和FasL多為陽性，Fas強陽性率分別達34.8%和69.2%，FasL強陽性率分別達30.4%和53.8%，均明顯高于正常組和輕度炎癥組（P＜0.05），同時中、重度肝炎組間也存在顯著性差異（P＜0.05），其分布除界面炎癥區外，肝小葉中也彌漫分布；肝組織表現正常的ASC血清sFas水平為（1.68±0.33）ng/L，而輕、中、重度肝炎患者則分別為（2.58±0.31）ng/L、（3.94±0.21）ng/L和（5.94±0.26）ng/L，均較正常組顯著升高（F=218.01，P＜0.01），各組間sFas水平也均具有統計學差異（P＜0.01）。結論Fas和FasL介導的肝細胞凋亡在慢性HBV攜帶者肝組織病變中可能起到了重要作用。

慢性HBV攜帶者；凋亡；Fas；Fas配體

大部分慢性HBV感染者是慢性HBV攜帶者（chonic asymptomatic HBV carrier，ASC）。部分ASC人群在肝功能持續正常多年后也會進展至肝硬化甚至肝癌[1，2]。因此，雖然ASC血清轉氨酶持續正常，而肝組織學卻并非完全靜止[3]，部分人群也會存在較重的肝組織損害。Fas-FasL是介導細胞凋亡的一對跨膜蛋白。我們選取120例ASC行肝組織活檢，檢測了Fas-FasL表達情況，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 病例來源選取2010年9月到2012年10月在本院肝病中心就診的120例ASC，男68例，女52例；年齡18～49歲，平均年齡（38.5±5.8）歲。診斷標準為HBsAg和HBV DNA持續陽性超過6月以上，無肝病相關癥狀和體征，1年內隨訪3次以上，血清轉氨酶持續正常。排除其他肝炎病毒感染和/或艾滋病病毒重疊感染，無自身免疫性肝病、藥物性肝損害及長期酗酒史。

1.2 肝活檢在超聲引導下，以16G肝穿針穿刺，連續獲取肝組織兩條，常規行病理學檢查。依據2000年發布的《病毒性肝炎防治方案》[4]關于慢性肝炎分級分期的標準，炎癥分為4級（G0～4），纖維化分為4期（S0～4）。根據肝穿刺病理學檢查結果，將ASC分為3組：即輕度（G1～2S0～2）；中度（G3S1～3）和重度（G4S2～4）。

1.3 肝組織Fas/FasL表達的檢測采用SP法，兔抗Fas及抗FasL單克隆抗體（1：100）、正常羊血清、羊抗多價生物素和辣根酶標記鏈霉卵白素試劑均購自北京中山公司。結果判斷：細胞漿及細胞膜出現黃色、棕黃色或棕褐色顆粒物為陽性細胞。在普通光鏡下每片隨機選取5個400倍視野，在每個視野下計數100個細胞。（-）為無明顯細胞著色或少量細胞呈淡黃色染色；（+）為10%～30%細胞陽性；（++）為大于30%細胞陽性。

1.4 血清sFas水平檢測采用ELISA法檢測（試劑盒為北京中山生物有限公司提供）。

1.5 統計學方法采用SPSS16.0軟件進行統計學分析，采用x2檢驗和方差分析，P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 Fas和FasL表達情況正常組肝組織基本無陽性表達，而輕度肝炎組以無表達或陽性表達為主，且陽性表達僅見于界面炎癥區的肝細胞及淋巴細胞；中、重度肝炎組則出現Fas和FasL陽性或強陽性表達，無陰性表達，除界面炎癥區外，肝小葉中也有彌漫陽性物質分布，肝竇壁內皮細胞、膽管細胞、炎癥區的梭形細胞等均有表達（圖1、2、3、4）。隨著炎癥程度加重，肝組織Fas和FasL的表達明顯增強。中、重度肝炎患者肝組織Fas強陽性表達率分別為34.8%和69.2%，FasL強陽性表達率分別為30.4%和53.8%，均明顯高于正常組和輕度肝炎組（P＜0.05，表1）。

表1 各組肝細胞Fas和FasL表達的比較

圖1 輕度肝炎患者肝組織Fas表達情況在匯管區周圍有陽性表達（SP，200×）

圖2 重度肝炎患者肝組織Fas陽性表達（SP，200×）

圖3 重度肝炎患者肝組織FasL表達情況肝細胞內呈顆粒狀表達（SP，200×）

圖4 中度肝炎患者肝組織FasL表達情況在肝小葉內呈灶狀陽性（SP，200×）

2.2 血清sFas水平正常組血清sFas水平為（1.68± 0.33）ng/L，而輕、中和重度組分別為（2.58±0.31）ng/L、（3.94±0.21）ng/L和（5.94±0.26）ng/L，各與正常組比均顯著升高（F=218.01，P＜0.01），重度肝炎患者血清sFas水平也顯著高于輕中度患者。

3 討論

HBV感染是肝硬化和原發性肝癌最主要的病因。慢性HBV攜帶者是指HBsAg和HBV DNA持續陽性超過6月以上，無肝病相關癥狀和體征，1年內隨訪3次以上，血清轉氨酶持續正常者[5]。ASC在漫長的感染過程中多數逐漸清除病毒后肝臟并無損害表現，但也有部分患者肝功能持續正常多年后會進展至肝硬化甚至肝癌[6]。據統計，對ASC患者進行肝組織活檢，僅有10%完全正常，輕微病變占11%～48%，其它則表現為慢性肝炎甚至肝硬化[7]。我們選取120例慢性HBV攜帶者進行肝組織活檢，發現肝組織完全正常者僅占11%，輕度肝炎占59%，而中、重度肝炎占30%，與文獻報道基本一致。

ASC與慢性乙型肝炎患者在臨床上的主要區別在于：慢性肝炎有明顯的肝病癥狀及反復肝功能異常，即血清ALT和AST有明顯升高，ASC則長期肝功能正常。那么，為何部分ASC患者肝功能長期正常，但肝組織病變仍會進展呢？HBV感染導致的細胞凋亡可作為一種較好的解釋。既往都認為在HBV感染過程中，肝炎病毒感染的肝細胞由主要組織相容性復合物（MHC）－Ⅰ類抗原限制的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）特異性識別并通過細胞溶解作用即細胞壞死途徑將其破壞，從而在清除病毒的同時也引起肝細胞的免疫損傷[8～10]。但最近研究發現，MHC－Ⅰ類抗原限制的CTL還可以非細胞溶解機制，即凋亡的形式來清除病毒及受染細胞，凋亡細胞碎裂為一些胞膜包裹的小體即凋亡小體，凋亡時肝細胞膜完整，細胞內容物無泄漏，因此ALT和AST等酶類未釋放到血中，也不會檢測到外周血酶學指標的升高，而大量凋亡小體可使庫普弗細胞活化，分泌大量的細胞因子，從而激活肝星狀細胞（HSC），分泌大量的ECM，引起肝纖維化甚至肝硬化[11～14]。

Fas和FasL是介導細胞凋亡的一對跨膜蛋白，FasL被稱為死亡因子，Fas與FasL結合，導致蛋白酶促級聯反應，導致細胞結構的破壞，引起DNA斷裂，染色體濃縮，引起細胞凋亡[15～18]。血清sFas是Fas基因轉錄過程中不同拼接所致跨膜蛋白缺乏的產物或Fas抗原被清除過程中的游離產物。因此，血清sFas可能是細胞Fas分子的胞外部分被水解后形成的。血清sFas可以作為細胞凋亡的預測因素。在乙型肝炎的發生、發展過程中，CTL可通過FasL與被感染的肝細胞上表達的Fas結合，介導靶細胞凋亡[19，20]。血清sFas對細胞凋亡可能起重要的調節作用。我們的研究發現ASC患者肝組織Fas和FasL主要表達于肝細胞膜及胞漿中，表達程度隨炎癥活動度加重而增強，尤其在匯管區周圍及周邊小葉更明顯，正常組基本無表達，而輕度組以無表達或陽性表達為主，僅見于界面區的肝細胞及淋巴細胞上；中、重度肝炎組則均有Fas和FasL的陽性及強陽性表達，無陰性表達，除界面炎癥區外，肝小葉中也彌漫分布，肝竇壁內皮細胞、膽管細胞等均有表達。以上的研究顯示反映凋亡的Fas-FasL的表達均隨著肝組織炎癥程度加重而增強，提示慢性HBV攜帶者肝組織炎癥與凋亡密切相關，我們推測凋亡可以在沒有明顯肝臟酶譜升高的情況下引起肝組織的損傷及纖維化，這種變化可能是一個長期的過程，最終也可導致較重的肝纖維化，甚至肝硬化。

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（收稿：2013-09-03）

（校對：陳從新）

Expression of Fas and Fas ligand in liver tissues from chronic asymptomatic hepatitis B virus carriers

Dai Xuefeng，Ma Yong，Xu Changjiang，et al.
Center for LiverDisease，123rdHospital，Bengbu233015，Anhui Province，China

ObjectiveTo investigate the expression of Fas antigen and Fas ligand（FasL）in liver tissues from chronic asymptomatic hepatitis B virus（HBV）carrier（ASC）.MethodsLiver biopsy specimen and sera from 120 individuals with ASC were obtained；The expression of Fas and FasL in liver tissues were detected by immunohistostaining.Serum levels of soluble Fas（sFas）and sFasL were measured by ELISA.ResultsOnly 11% had a normal appearance of liver tissues in the 120 chronic HBV carriers，and 59%had mild and other 30%had moderate to severe hepatitis；Fas and FasL were negative in normal liver tissues，almost absent or only slightly positive in hepatocytes and lymphocytes in inflammatory zone of the interface in liver tissues with mild hepatitis，and strongly positive in those with moderate or severe hepatitis，showing a pattern of diffused staining in the interface area of hepatic lobules；The strongly positive rate for Fas and FasL in moderate（34.8%and 30.4%，respectively）and severe hepatitis（69.2%and 53.8%，respectively）was significantly higher than that in mild hepatitis or normal liver tissues（P＜0.05）；Serum sFas from persons with normal liver tissues was（1.68±0.33）ng/L，and they increased significantly to（2.58±0.31）ng/L，（3.94±0.21）ng/L and（5.94±0.26）ng/L，respectively，from individuals with mild，moderate and severe hepatitis（P＜0.01）.ConclusionThe Fas-FasL mediated apoptosis might play an important role in the disease progress of ASC.

Chronic asymptomatic hepatitis B virus carrier；Apoptosis；Fas；Fas ligand

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.015

233015安徽省蚌埠市解放軍第123醫院肝病中心

代雪楓，女，39歲，醫學碩士，主治醫師。主要從事病毒性肝炎及脂肪性肝炎的診斷與治療研究。E-mail：daisnowfe@163. com