原發(fā)性肝癌患者微波消融治療后外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化

闞 曉，潘家超，荊 燕，都曉偉，史兆章，韓紹磊，張海濤，鄭昭敏

·肝癌·

原發(fā)性肝癌患者微波消融治療后外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化

闞 曉，潘家超，荊 燕，都曉偉，史兆章，韓紹磊，張海濤，鄭昭敏

目的觀察原發(fā)性肝癌患者微波消融治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化。方法152例原發(fā)性肝癌患者在微波消融治療前1d、治療后1 w和4 w，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞數(shù)量，采用全自動(dòng)生化免疫分析儀檢測(cè)甲胎蛋白水平。術(shù)后1 m進(jìn)行肝臟CT增強(qiáng)掃描觀察。結(jié)果在微波消融治療后1 w和4 w，患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞上升至（26.5±3.8）%和（32.3±5.1）%，CD4+/CD8+比值上升至（1.12±0.43）和（1.51±0.40），而CD8+T淋巴細(xì)胞下降至（47.2±7.7）%和（28.1±7.3）%，與治療前1d時(shí)基線水平[CD4+、CD8+和CD4+/CD8+分別為（21.4±4.1）%、（58.6±7.8）%和（0.98±0.45）]比，變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；甲胎蛋白水平由基線水平[（1109±727）ng/ml]下降，術(shù)后1w和4w分別為（890±681）ng/ml和（215±18）ng/ml（P＜0.01）；微波消融后1m行增強(qiáng)CT檢查，示病灶完全滅活率為97.4%(148/152)。結(jié)論微波消融治療使原發(fā)性肝癌患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群向CD4+T淋巴細(xì)胞優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)變，可能對(duì)治療效果的取得發(fā)揮了作用。

原發(fā)性肝癌；淋巴細(xì)胞亞群；微波消融；CD4+/CD8+

原發(fā)性肝癌患者微波消融治療后外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占全世界發(fā)病率的42%。我國(guó)肝癌年死亡率為20.4/10萬(wàn)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[1]。微波消融（microwave ablation，MWA）已成為肝癌微創(chuàng)治療的主要手段之一，尤其能延長(zhǎng)中小肝癌患者的生存時(shí)間。MWA具有微創(chuàng)優(yōu)勢(shì)，并可誘導(dǎo)腫瘤患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化。本研究通過(guò)觀察肝癌患者M(jìn)WA治療前后外周血CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及甲胎蛋白（AFP）的變化，探討MWA對(duì)PLC患者免疫功能的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2010年2月至2012年3月我院住院并接受MWA治療的PLC患者152例，男109例，女43例；年齡31～72歲，中位年齡51歲。其中腫瘤直徑≤3 cm者123例，腫瘤直徑3 cm～5 cm者29例。肝功能Child-Pugh A級(jí)96例、B級(jí)54例、C級(jí)2例；有肝硬化者132例；手術(shù)前血清AFP＞400 ng/ml者131例，＜400 ng/ml者17例，＜13.6 ng/ml者4例。納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)大血管浸潤(rùn)或肝外轉(zhuǎn)移，每個(gè)病灶均能檢測(cè)到血流，無(wú)門(mén)靜脈癌栓或肝外轉(zhuǎn)移，腫瘤直徑≤5 cm，腫瘤結(jié)節(jié)≤3個(gè)，凝血功能基本正常。近半年未接受過(guò)免疫調(diào)節(jié)劑治療。將患者分成MWA治療組和對(duì)照組，兩組在年齡、性別、體重指數(shù)、腫瘤結(jié)節(jié)等方面無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

1.2 治療方法治療前所有患者均簽署知情同意書(shū)。在超聲（飛利浦iU22型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率3.5MHz）引導(dǎo)下，用一次性醫(yī)用薄膜包裹探頭經(jīng)皮肝穿刺行MWA[南京福中醫(yī)療高科有限公司生產(chǎn)的肝癌微波消融儀（METI-IV）]治療[2]，輸出功率50～90 W，微波穿刺針為MTC-180-2.0，配用蠕動(dòng)泵作為水循環(huán)動(dòng)力泵，冷卻水用室溫生理鹽水（20℃～22℃）。根據(jù)腫瘤體積大小確定消融時(shí)間，其標(biāo)準(zhǔn)為：對(duì)瘤體直徑≤3 cm者，治療時(shí)間為5～8 min；對(duì)瘤體直徑3 cm～5 cm者，治療時(shí)間為8～15 min。對(duì)于一次消融不能覆蓋腫瘤體積者，則采取移位穿刺點(diǎn)和重復(fù)手術(shù)法，直至腫瘤被全部消融。

1.3 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)采集EDTA-K2抗凝血2 ml，取100 μL，與10 μL抗CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP熒光抗體孵育15 min，加入溶血素2 ml，室溫孵育10 min，見(jiàn)液體清澈透明后，1000 r/m離心5 min，棄上清。用2 ml PBS洗2次，棄上清后，加入0.5ml PBS懸浮細(xì)胞，在2 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BM公司生產(chǎn)的FACS Canto流式細(xì)胞儀，雙激光六色）檢測(cè)患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群（三色熒光抗體CD4-FITC/CD8-PE/PerCR及溶血素均購(gòu)自BD公司）。采用BDFACSDiva軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 觀察指標(biāo)采用Ci8200全自動(dòng)生化免疫儀檢測(cè)血清AFP（美國(guó)雅培公司）；采用飛利浦16層螺旋CT-Brilliance16檢查肝臟（上海博鈺醫(yī)療器械有限公司）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和成組設(shè)計(jì)樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 療效情況本組患者隨訪至2012年7月，143例（94.08%）生存，9例死亡，其3 m、6 m和12 m生存率分別為100%、98.0%和94.1%。術(shù)前及術(shù)后1 m，行常規(guī)肝臟CT掃描，判斷消融效果（圖1）。典型病例術(shù)前及術(shù)后增強(qiáng)CT檢查結(jié)果對(duì)比病灶消融滅活率為97.4%。

圖1 A原發(fā)性肝癌術(shù)前增強(qiáng)CT

圖1 B微波消融后1月增強(qiáng)CT

2.2 MWA治療前后患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及AFP的變化見(jiàn)圖2和表1。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)

表1 152例患者治療前后T細(xì)胞亞群（%）和AFP（±s）的變化

與治療前比，①P＜0.05；②P＜0.01

3 討論

PLC的5 a平均生存率只有7%左右[3]。MWA已成為肝癌微創(chuàng)治療的主要方法之一[4]，并取得了良好的臨床療效。小肝癌患者經(jīng)MWA治療能達(dá)到根治性效果[5]。機(jī)體的免疫功能與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。在肝癌患者中，T細(xì)胞功能受抑制主要表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞數(shù)量下降，CD4+/CD8+比值倒置，腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài)[6，7]。AFP是肝癌細(xì)胞分泌的特征性蛋白標(biāo)志，高水平的AFP對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有明顯的抑制作用[8，9]。肝癌患者外周血T細(xì)胞數(shù)量與血清AFP濃度、腫塊大小、臨床分期和腫瘤惡性程度密切相關(guān)。

MWA治療不僅直接使腫瘤細(xì)胞凝固壞死，原位徹底滅活肝癌組織，而且還能提高免疫細(xì)胞數(shù)量及其抗腫瘤功能，而手術(shù)切除腫瘤有可能直接或間接地抑制細(xì)胞免疫[10]。MWA能提高機(jī)體免疫功能，其機(jī)制為：①M(fèi)WA減輕了患者的腫瘤負(fù)荷及相應(yīng)的免疫抑制因子；②MWA在腫瘤局部造成了炎性環(huán)境，有利于抗原提呈細(xì)胞提取、加工腫瘤抗原，誘發(fā)抗腫瘤免疫；③MWA降低了免疫抑制因子的水平，腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性IL-2受體（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）能中和活化T淋巴細(xì)胞分泌IL-2，使肝癌患者IL-2水平降低；④MWA可刺激淋巴細(xì)胞活化，釋放細(xì)胞因子，通過(guò)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[11]。Schueller等[12]研究發(fā)現(xiàn)，熱療通過(guò)加強(qiáng)肝癌細(xì)胞HSP70和HSP90的表達(dá)，能增加對(duì)肝細(xì)胞癌的免疫能力；⑤AFP具有免疫抑制作用，MWA后患者AFP明顯下降，進(jìn)一步解除了機(jī)體的免疫抑制。

彭齊榮[13]等人研究報(bào)道，MWA治療后肝癌患者免疫功能增強(qiáng)，將對(duì)肝癌患者的預(yù)后起到重要作用。本研究中，經(jīng)MWA治療1w后患者CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始升高，CD4+/CD8+細(xì)胞比值升高，抑制性CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量降低，說(shuō)明患者T細(xì)胞免疫功能從術(shù)后1w開(kāi)始升高，4 w后機(jī)體的免疫功能明顯升高，在MWA治療后，上述變化能持續(xù)30 d以上[14]。MWA能夠明顯改善患者機(jī)體的免疫功能。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，治療后T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量和巨噬細(xì)胞內(nèi)的次級(jí)溶酶體數(shù)量明顯增多，說(shuō)明這些免疫細(xì)胞的功能明顯增強(qiáng)[15]。對(duì)患者不同部位兩個(gè)肝癌結(jié)節(jié)的MWA治療對(duì)照研究表明，消融一個(gè)結(jié)節(jié)后，另一個(gè)結(jié)節(jié)內(nèi)部免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量也增加，體積增大，而且與治療結(jié)節(jié)內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞表型相同，產(chǎn)生同樣的免疫應(yīng)答反應(yīng)[16]。宿主與腫瘤的關(guān)系是一種動(dòng)態(tài)平衡，MWA打破了宿主與腫瘤之間的免疫動(dòng)態(tài)平衡。經(jīng)MWA治療后，絕大多數(shù)患者AFP水平恢復(fù)至正常，患者的細(xì)胞免疫功能和抗腫瘤能力得到增強(qiáng)，刺激了機(jī)體發(fā)揮抗腫瘤作用。外周血T細(xì)胞亞群是反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的較好指標(biāo)，檢測(cè)PLC患者M(jìn)WA術(shù)后外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平，有助于了解患者的免疫狀態(tài)，以進(jìn)一步評(píng)估MWA的療效，指導(dǎo)患者的綜合治療，判斷患者預(yù)后。

[1]Devergesten CL.Alteration in the postnatal development of the cerebellar cortex due to zinc deficiency.Dev Brain Res，2004，16:11-26.

[2]He N，Wang W，Ji Z，et al.Microwave ablation:An experimental comparative study on internally cooled antenna versus non-internally cooled antenna in liver models.Acad Radiol，2010，17（7）:894-899.

[3]Seeff LB，Hoofnagle JH.Epidemiology of hepatocellular carcinoma in areas of low hepatitis B and hepatitis C endemicity. Oncogene，2006，25（27）:3771-3777.

[4]彭齊榮，張羅生，謝蘇民，等.冷循環(huán)微波技術(shù)治療肝癌的臨床研究.現(xiàn)代消化及介入診療，2005，10（4）:200-202.

[5]陳敏山，李錦清，梁惠宏，等.經(jīng)皮射頻消融與手術(shù)切除治療小肝癌的療效比較.中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85（2）:80.

[6]Neumann-Haefelin C，Blum HE，Chisari FV，et al.T cell response in hepatitis C virus infection.J ClinVirol，2005，32（2）: 75-85.

[7]吳發(fā)偉，馮雷，黨亞正，等.高強(qiáng)度聚焦超聲對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌患者機(jī)體免疫功能的影響.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18（3）：517-519.

[8]鄭亮，葉玲麗.原發(fā)性肝癌甲胎蛋白升高對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)抑制的觀察.中華腫瘤雜志，2002，24（1）:57-58.

[9]郭銳芳，楊少奇.甲胎蛋白陰性肝癌的臨床特點(diǎn)及預(yù)防分析.臨床肝膽病雜志，2009，25（6）:454-455.

[10]Ben-Eliyahu S.The promotion of tumor metastasis by surgery and stress:immunological basis and implications for psychoneuroimmunology.Brain Behav Immune，2003，17（2）:S27-36.

[11]唐鐵鋼，賀澤文.射頻消融對(duì)惡性腫瘤患者免疫功能影響.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2008，16（4）:679-681.

[12]Schueller G，Stift A，F(xiàn)riedl J，et al.Hyperthermia improves cellular immune response to human hepatocellular carcinoma subsequent to co-culture with tumor lysate pulsed dendritic cells. Int J Oncol，2003，22（6）:1397-1402.

[13]彭齊榮，肖必，張健，等.微波凝固術(shù)后肝癌患者免疫功能變化的初步研究.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011，19（3）:483-485.

[14]董寶瑋，張晶，梁萍，等.肝癌經(jīng)皮微波凝固治療前后局部免疫細(xì)胞浸潤(rùn)影響因素的分析.中華醫(yī)學(xué)雜志，2002，82（6）:393.

[15]Dong BW，Zhang J，Liang P，et al.Sequential pathological and immunologicanalysisofpercutaneousmicrowavecoagulation therapy of hepatocellular carcinoma.Int J Hyperthermia，2003，29（2）:119-133.

[16]張晶，梁萍，于曉玲，等.局部微波凝固治療肝癌與瘤區(qū)細(xì)胞免疫效應(yīng).中國(guó)藥物與臨床，2003，3（4）:295.

（收稿：2012-12-24）

（校對(duì)：陳從新）

Changes in peripheral T lymphocyte subsets in patients underwent microwave ablation for primary liver cancer

Kan Xiao，Pan Jiachao，Jing Yan，et al.
Infectious Disease Hospital，Shandong University，Jinan 250021，Shandong Province，China

ObjectiveTo investigate the changes of peripheral T lymphocyte subsets in patients with primary liver cancer（PLC）underwent microwave ablation.Method152 patients with PLC were recruited and received microwave ablation treatment.One day before，and 1 week and 4 weeks after the treatment，the distributions of peripheral T lymphocyte subsets were determined by flow cytometry，and serum levels of alpha fetoprotein were measured by a automatic biochemical immune analyzer.Contrast-enhanced CT scans were performed in all patients one month after the treatment.ResultsThe percentages of CD4+or CD8+T lymphocytes and the ratio of CD4+/CD8+in this series one day before the treatment were（21.4±4.1）%，（58.6±7.8）%and（0.98±0.45），respectively，while the percentages of CD4+T lymphocytes increased to（26.5±3.8）%and（32.3±5.1）%，and the CD4+/CD8+ratio increased to（1.12±0.43）and（1.51±0.40），but CD8+T lymphocytes decreased to（47.2±7.7）%and（28.1±7.3）%，respectively（P＜0.05）one week and 4 weeks after microwave ablation;serum alpha fetoprotein levels were significantly decreased from the baseline[（1109±727）ng/ml]to（890±681）ng/ml 1 week or（215±18）ng/ml 4 weeks after ablation（P＜0.01）；contrast-enhanced CT scans revealed a complete ablation rate of 97.37%（148/152）for tumors one month after therapy.ConclusionsMicrowave ablation for PLC shifts the distribution of peripheral blood T lymphocyte subsets toward a CD4+cells-favorite status，which might play a role in improving the efficacy of the therapy.

Hepatoma；Microwave ablation；T lymphocyte subsets

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.021

250021濟(jì)南市山東大學(xué)附屬濟(jì)南市傳染病醫(yī)院介入科（闞曉，史兆章，韓紹磊，張海濤，鄭昭敏）；檢驗(yàn)室（荊燕）；醫(yī)學(xué)院（潘家超）；山東省濰坊市昌樂(lè)縣人民醫(yī)院感染病科（都曉偉）

闞曉，40歲，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師。主要從事肝癌診斷與治療學(xué)研究。E-mail:jinankanxiao@sina.com

共同第一作者：潘家超男，25歲，碩士研究生

鄭昭敏，E-mail:zhaominzheng6808@126.com