Box-Behnken設計及正交設計優選復方龍砂顆粒提取工藝

曾 銳， 任桂友， 王 爽， 瞿 燕， 盛 蓉

（1.西南民族大學民族醫藥研究院，四川成都610041；2.成都中醫藥大學藥學院/中藥材標準化教育部重點實驗室，四川成都611137；3.成都中醫藥大學附屬醫院，四川成都 610075）

Box-Behnken設計及正交設計優選復方龍砂顆粒提取工藝

曾 銳1， 任桂友1， 王 爽1， 瞿 燕2*， 盛 蓉3

（1.西南民族大學民族醫藥研究院，四川成都610041；2.成都中醫藥大學藥學院/中藥材標準化教育部重點實驗室，四川成都611137；3.成都中醫藥大學附屬醫院，四川成都 610075）

目的 優選復方龍砂顆粒的提取工藝。方法 采用響應面法，以揮發油體積為響應值，選取加水量、浸泡時間和蒸餾時間三個因素進行中心組合試驗優化揮發油提取工藝；采用正交試驗設計，以黃芩苷量和干膏率二者的綜合評分值為指標，對揮發油提取殘渣與地龍等其余6味藥材合并后所進行的提取工藝中的加水量、提取時間和提取次數進行優選。結果 揮發油提取最佳工藝為加10倍量水，浸泡36 min，蒸餾提取5.5 h；水提取最佳工藝為提取3次，每次加水10倍，提取1 h。結論 實驗合理的利用了兩個設計方案的特點，所優選的提取工藝穩定可行。

Box-Behnken；復方龍砂顆粒；提取工藝；正交設計

復方龍砂顆粒原為中藥處方湯劑劑型，由地龍、砂仁、黃芩、蒼術等九味中藥組成，具有利尿通淋、活血祛毒的功效，臨床用于糖尿病合并高尿酸血癥的治療。因湯劑煎煮不便，服用量大，不適于現代用藥的需求，故將湯劑改為顆粒劑。

本處方中砂仁、蒼術等共三味藥材中含有揮發油成分，同屬芳香化濕藥，可用于濕盛困脾、脘痞腹脹等癥。現代藥理學研究表明該類藥物揮發油多具有抗炎、止瀉、鎮痛作用，其中蒼術揮發油還具有利尿、降血糖作用，且揮發油利尿作用強于水煎液［1-3］。Box-Behnken［4-5］是一種可以評價指標和因素之間非線性關系的實驗設計方法，且無需多次試驗，故選用Box-Behnken設計對此三味含揮發油的藥物進行提取，并以響應面法優選提取工藝。而黃芩中的主要成分黃芩苷具有改善糖尿病腎病及治療糖尿病慢性并發癥的作用［6-7］，因此另以黃芩苷轉移率及干膏率兩者綜合評分作為指標，以加水量、提取時間和提取次數為影響因素，進行正交實驗設計，優選水提工藝，以期將該處方的提取工藝最優化并保證臨床療效。

1 儀器與試藥

Waters 2695/2996型高效液相色譜儀 （包括真空脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱，2996 PDA檢測器，Empower化學工作站，美國 Waters公司）；DiamonsilC18（2）（5 μm，150 mm×4.6 mm）色譜柱；電子天平 （沈陽龍騰電子有限公司，ESJ200-4）；ZDHW型調溫電熱套 （北京）；旋轉蒸發儀 （上海申生科技有限公司，SENCO-R系列）附帶恒溫水浴鍋 （上海申生科技有限公司，SENCO-R系列W201）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海一恒科學儀器有限公司）。

地龍、砂仁、黃芩、蒼術、黃連等九味藥材均購于四川省新荷花中藥飲片股份有限公司，經西南民族大學民族醫藥研究院劉圓教授鑒定。地龍為鉅蚓科參環毛蚓Pheretima aspergillum（E.perrier）干燥體，砂仁為姜科植物陽春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果實，黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，蒼術為菊科植物北蒼術Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.；黃芩苷對照品 （由中國生物制品鑒定所提供，批號 （110715-201117）；乙醇 （95%）分析純；其他試劑均為色譜純。

2 試驗方法與結果

2.1 提取工藝 將砂仁、蒼術等含有揮發油的藥材提取揮發油，殘渣與地龍等其余六味藥材合并，加適量的水進行提取，測定提取液中黃芩苷質量濃度，計算黃芩苷量。

黃芩苷含有量=提取液中黃芩苷的質量濃度×提取液體積/黃芩藥材的質量

2.2 干膏率的測定 精密吸取各提取液50 mL，置已恒定質量的蒸發皿中，按《中國藥典》2010年版一部附錄 IX G干燥失重測定法測定，計算干膏率。

2.3 黃芩苷的測定方法

2.3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-磷酸 （47∶53∶0.2）為流動相；柱溫為30℃；體積流量為1 mL/min；檢測波長為280 nm。在選定色譜條件下，理論塔板數按黃芩苷峰計算應不低于2 500，分離度＞1.5，陰性無干擾。

2.3.2 對照品溶液的制備 取在60℃減壓干燥4 h的黃芩苷對照品，精密稱取黃芩苷對照品4.73 mg，置于5 mL量瓶中，加適量流動相甲醇超聲處理10 min，放冷，加流動相至刻度，搖勻，精密量取1 mL溶液置于10 mL量瓶中，加流動相甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 標準曲線的繪制 分別精密吸取上述對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置5 mL棕色量瓶中，加流動相甲醇至刻度，搖勻，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積 （Y）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標進行回歸，得回歸方程為y=30 282 891.806 7x+113 730.533 3，相關系數r=0.999 9（n=6）。表明黃芩苷在56.9～682.8 ng范圍內線性關系良好。

2.3.4 供試品溶液的制備 精密量取提取液適量于量瓶中，加流動相甲醇適量，超聲處理10 min，放冷，再加流動相定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3.5 測定方法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，測定，計算提取液中黃芩苷的含有量。

2.3.6 精密度試驗 精密吸取黃芩苷對照品溶液0.6 mL，置10 mL棕色量瓶中，加流動相甲醇至刻度，搖勻，即得。按前述色譜條件，連續進樣6次，測定峰面積RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗 精密量取同一份供試品溶液10 μL，分別于0、1、2、4、6、8 h進樣，按上述色譜條件測定峰面積，測得峰面積RSD為0.33%，表明樣品溶液在8 h內穩定性良好。

2.3.8 重復性試驗 分別精密量取6份供試品溶液10 μL，按前述色譜條件進行進樣，測定峰面積，計算供試品中黃芩苷的量，結果RSD為0.88%，表明該方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知含有量供試品溶液6份，分別精密加入一定量的黃芩苷對照品，按上述供試品制備與測定方法進行測定，計算黃芩苷檢出量，結果測得黃芩苷平均回收率為100.13%，RSD為0.018%。

2.3.10 陰性對照試驗 按處方比例，稱取除黃芩藥材外的其余各味藥材，分別加10倍水，煎煮3次，每次1 h，減壓濃縮至500 mL，按上述供試品溶液的制備方法制備陰性供試品溶液。按上述方法測定，結果表明，陰性對照溶液在黃芩苷相應位置無吸收，處方中其他藥味對本測定無干擾。

2.4 揮發油提取工藝優選

2.4.1 Box-Behnken設計 依照《中國藥典》2010年版一部附錄X D揮發油測定法甲法提取揮發油。以揮發油體積為響應值，加水量、浸泡時間及蒸餾時間為影響因素，通過Box-Behnken設計［8-11］進行響應面分析，優化揮發油提取條件。各因素水平見表1。

2.4.2 響應面法分析 實驗所得結果 （見表2、表3）經Design Expert 8.0.5b軟件進行多元回歸擬合及優化，得到揮發油體積對加水量A、浸泡時間B和蒸餾時間C優化后的二元回歸方程：

揮發油體積 =－4.550+1.12A－4.922×10－3B+0.088C+7.500×10－4AB－0.057A2－3.556×10－5B2－7.722×10－3C2

對該回歸模型進行方差分析，從表3中可以看出，P＜0.000 1，表明響應回歸模型達到了極顯著水平；失逆差＞0.05，不顯著；模型的修正系數R2=0.979 9，說明模型擬合度良好；模型修正相關系數R2Adj=0.964 2，說明該方程較好的反應了加水量，浸泡時間和蒸餾時間與揮發油體積的關系。

表2 揮發油提取響應面分析方案及結果

表3 回歸模型方差分

2.4.3 提取工藝預測 由Design Expert 8.0.5b軟件分析得出的響應曲面及等高線圖 （見圖1）可知，加水量對揮發油體積影響最大。經Design Expert軟件分析篩選，得到揮發油提取的最佳工藝條件為：加水量10.02倍，浸泡時間35.80 min，蒸餾時間為5.71 h，提取揮發油體積的預測值為1.19 mL。考慮實際操作不便，故將實驗條件改為加水量10倍，浸泡時間36 min，蒸餾時間5.5 h。

圖1 交互因素作用對揮發油體積影響的效應面及等高線

2.4.4 驗證試驗 按處方比例取豆蔻、砂仁和蒼術藥材，共3份，按優選的工藝條件提取揮發油。3次試驗揮發油體積分別為1.21、1.19、1.18 mL，RSD為1.28%，表明該工藝穩定可行，重復性好。

2.5 水提工藝條件優選

2.5.1 正交試驗 采用正交試驗設計［12-15］，以加水量、提取時間、提取次數為考察因素，每個因素確定3個水平，選取正交表L9（34），以黃芩苷轉移率為評價指標，對水提工藝進行優選，因素水平表見表4，結果見表5，方差分析見表6。

表4 正交試驗因素水平

表5 正交試驗結果

表6 正交試驗方差分析

結果分析：由表5直觀分析可知，影響本制劑提取效果的因素順序為：煎煮次數＞加水量＞煎煮時間，煎煮次數對提取效果影響最大。經方差分析，煎煮次數對提取效果有極顯著影響，加水量和煎煮時間對提取無顯著影響，考慮工廠實際工作需要，故確定提取工藝為A2B3C2，即加10倍水，煎煮3次，每次1 h。

2.5.2 驗證試驗 取處方量藥材，平行3份，按確定的最佳水提工藝進行提取，見表7。結果顯示，驗證試驗的黃芩苷轉移率優于正交試驗中大部分試驗結果，說明確定的最佳水提工藝穩定可行。

表7 驗證試驗結果

3 討論

3.1 中藥成分復雜，多通過配伍組合或者配伍之后產生新的藥效成分進而發揮治療效果，比較重視整體觀念。經查閱相關資料得知，該處方中砂仁、蒼術等三味藥材的揮發油具有一定的抗炎、鎮痛、降血糖作用。因此，本實驗將揮發油整體單獨選作考察指標，以優化提取工藝。同時黃芩藥材中的有效成分黃芩苷具有很好的治療糖尿病慢性并發癥的作用，且易溶于水，故以水為溶劑進行提取，并采用正交試驗設計優化確保臨床療效。

3.2 Box-Behnken設計多用于確信試驗因素對試驗指標在非線性影響條件下因素與指標之間的分析，與中心復合設計相比，其可不必連續進行多次試驗，且因素數相同時，Box-Behnken要比中心復合設計試驗組合數要少。本實驗選擇該設計方法進行揮發油提取工藝的試驗設計，并通過擬合二元回歸方程，繪制響應面與等高線圖，可直接得出影響因素的變化規律，清晰、準確。另以正交試驗設計方法優選水提工藝，在保證試驗結果準確的同時減少試驗次數，節約成本，節省時間。

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曾 銳 （1976—）男，副教授，博士，主要從事藥物制劑及民族藥的研究。Tel：（028）85522315，E-mail：Mackzeng@gmail.com

*通信作者：瞿 燕，女，主要從事中藥新制劑與新劑型研究。Tel：（028）61800231，E-mail：quyan028@126.com