酵母細(xì)胞壁多糖和硫化氫對羅氏沼蝦3種免疫酶活性的影響

許燕余靜王芳張丹鳳

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酵母細(xì)胞壁多糖和硫化氫對羅氏沼蝦3種免疫酶活性的影響

許 燕余 靜王 芳 張丹鳳

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 上海 200234)

酵母細(xì)胞壁多糖; 硫化氫; 羅氏沼蝦; ACP; POD; PPO

蝦類病害是嚴(yán)重影響蝦類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素, 而蝦類疾病的發(fā)生與養(yǎng)殖水體環(huán)境的惡化有明顯的關(guān)系[1, 2], 因此重視水體生態(tài)環(huán)境質(zhì)量, 關(guān)注環(huán)境因子對蝦蟹類非特異性免疫的影響, 已成為新的研究熱點[3, 4]。硫化氫是水產(chǎn)動物養(yǎng)殖水體中常見的有毒害作用的物質(zhì), 也是一個重要的監(jiān)測養(yǎng)殖水環(huán)境的化學(xué)指標(biāo), 硫化氫污染會導(dǎo)致蝦類免疫力降低和疾病的發(fā)生, 研究表明養(yǎng)殖水體的硫化氫濃度達(dá)0.15 mg/L時, 即會引起導(dǎo)致羅氏沼蝦免疫功能明顯下降[5]。酵母細(xì)胞壁多糖能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫, 已被證明是一種有效的水產(chǎn)類養(yǎng)殖動物免疫增強劑。已有的研究表明采取投喂、浸浴或注射酵母細(xì)胞壁多糖的辦法可以提高蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫抗病能力[6, 7]。那么, 在一定濃度H2S污染存在的情況下酵母細(xì)胞壁多糖是否還能繼續(xù)有效地發(fā)揮其免疫增強劑的作用呢？有關(guān)這方面的研究還未見報道。

本研究以酸性磷酸酶(Acid phosphatase , ACP)、過氧化物酶(Peroxidase, POD)、酚氧化酶(Phenoloxidase, PPO)這三種重要的對蝦免疫酶[7, 8]為指標(biāo), 研究分析酵母細(xì)胞壁多糖浸浴處理對羅氏沼蝦()體內(nèi)肝臟和鰓組織中這3種免疫酶活力的影響, 并分別研究了在一定濃度H2S (0.15mg/L)污染存在的情況下, 預(yù)先經(jīng)過酵母細(xì)胞壁多糖浸浴的和未經(jīng)酵母細(xì)胞壁多糖浸浴的羅氏沼蝦體內(nèi)肝臟和鰓等2種組織中ACP、POD、PPO酶活力的變化, 目的是研究酵母細(xì)胞壁多糖和H2S這2種環(huán)境因子交互作用對養(yǎng)殖蝦類免疫功能的影響, 為進(jìn)一步研究蝦類生態(tài)養(yǎng)殖水體環(huán)境的調(diào)控及病害免疫防治提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的羅氏沼蝦購自上海市徐匯區(qū)冠生園路漕河涇菜市場, 體色正常, 健康活潑。選擇體長10—12 cm、體重約為12—16 g的個體。

酵母細(xì)胞壁多糖由湖北省安琪酵母有限公司提供。該產(chǎn)品中主要成分為β-葡聚糖≥20%、α-甘露聚糖肽≥20%、幾丁質(zhì)≥2.0%、肽類及蛋白質(zhì)≥30%。(產(chǎn)品批號: 20100601008)

1.2 實驗蝦分組與處理

將實驗蝦在聚乙烯水簇箱(長×寬×高＝58 cm×43 cm× 39 cm)中暫養(yǎng)2d后, 先分成2組, 每組20尾。1組為對照組飼養(yǎng)在不添加任何成分的養(yǎng)殖水體中, 編號為A; 另一組水體中添加酵母細(xì)胞壁多糖(濃度為125 mg/L)[9], 編號為B。水溫 20—25℃, pH 7.3±0.2, 自然光照, 連續(xù)充氣。每天8: 00和17: 00各投餌一次, 換水 1/3, 用虹吸法去除排泄物和多余餌料。飼養(yǎng)96h后, 從上面A、B組中各取出10尾蝦及其養(yǎng)殖水體于另外2個水族箱, 分別編號為C、D, 再分別加入0.1 g/L硫化鈉母液至水體中硫化氫濃度為0.15 mg/L, 12h后分別從編號為A、B、C、D的4組中取樣。即A組(純水浸浴108h)、B組(125 mg/L酵母細(xì)胞壁多糖水溶液浸浴108h)、C組(純水浸浴96h + 0.15 mg/L H2S水溶液浸12h)、D組(125 mg/L酵母細(xì)胞壁多糖水溶液浸浴96h+0.15 mg/L H2S水溶液浸12h)。每一處理組設(shè)3 個平行。

1.3 取樣

按上述處理方式飼養(yǎng)4組實驗蝦108h后, 從編號為A、B、C、D的各處理組取8尾沼蝦迅速放入冰盤內(nèi)解剖, 分別取蝦的肝臟、鰓2種組織, 將濾紙吸干組織上的液體后稱重, 并按1︰9 (/)比例加入預(yù)冷的提取液(0.1 mol/L pH 7.0 PBS), 于冰浴中用玻璃勻漿器勻漿。勻漿后經(jīng)12000 r/min, 4℃條件下離心30min, 取上清液作為粗酶液, 用于酶活的測定。

1.4 樣品分析

磷酸苯二鈉法[10]測定ACP酶活力, 0.9 mL 0.1 mol/L的醋酸緩沖液(pH 4.5)加入1 mL 0.01 mol/L對硝基苯磷酸二鈉(PNPP)中, 37℃預(yù)熱5min, 然后加入0.1 mL酶液, 混勻后于37℃保溫15min, 用2.0 mL 0.1 mol/L的NaOH終止反應(yīng)。以每100 mL樣品在37℃水浴中與底物作用60min, 產(chǎn)生1.0 mg酚者為一個活力單位(U)。

愈創(chuàng)木酚法[11, 12]測定POD酶活力, 50 mL 0.1 mol/L 的PBS (pH 7.0)中加入19 μL 30%的雙氧水和28 μL的愈創(chuàng)木酚制成反應(yīng)液, 取3 mL反應(yīng)液與1 mL酶液混勻后, 測定470 nm的光吸收值。每隔1min測定一次, 測定15min。以每分鐘內(nèi)光密度變化0.01為1個POD活力單位。計算公式如下: POD總活性＝D470×樣品液總體積/(0.01×反應(yīng)酶液體積×反應(yīng)時間×鮮重)。

參照Ashida[13]和昌鳴先等[14]方法測定PPO酶活力, 以0.01 mol/L L-DOPA為特異性底物, 將3 mL 0.1 mol/L 磷酸鉀鹽緩沖液(pH 6.0)與0.1 mL待測酶液及0.1 mL底物于28℃恒溫水浴中混勻, 每隔2min測定490 nm的光吸收值, 測定15min。以試驗條件下每分鐘內(nèi)光吸收值變化0.001記作為1個PPO酶活力單位。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 使用 SPSS 13.0分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析, Duncan’s 法進(jìn)行多重比較, 檢驗處理間的差異顯著性,<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 酵母細(xì)胞壁多糖和H2S對羅氏沼蝦鰓、肝臟中ACP酶活力的作用

由表1可知, 對照組(A組)羅氏沼蝦鰓和肝臟中ACP酶活力差別不大, 經(jīng)125 mg/L酵母細(xì)胞壁多糖浸浴108h處理后, 實驗B組蝦體內(nèi)鰓和肝臟中ACP酶活力明顯提高, 且均與對照組有顯著差異 (<0.05), 尤其是肝臟中ACP酶活力增加最高達(dá)(22.759±0.787) U/mL。這說明 125 mg/L酵母細(xì)胞壁多糖能明顯提高羅氏沼蝦鰓和肝臟中ACP酶活力。

表1 酵母細(xì)胞壁多糖和硫化氫作用下羅氏沼蝦的ACP酶活力(Mean±SD)

注: 上標(biāo)字母 a者表示與A組有顯著差異 (<0.05), 上標(biāo)字母b表示與C組有顯著差異(<0.05) ; 下同

Note: The same column with superscripts a means significant differences in activity in comparison with the control in the same array (<0.05), with b means significant differences in activity in comparison with the C in the same array (<0.05); the same applies bellow

純水浸浴96h后, 加入0.15 mg/L H2S浸浴12h后, 與對照組相比, 實驗C組蝦體內(nèi)鰓中ACP酶活力明顯下降, 且與對照組有顯著差異 (<0.05), 但是肝臟中ACP酶活力卻明顯提高(<0.05)。這表明0.15 mg/L H2S能明顯降低羅氏沼蝦鰓中ACP酶活力。

125 mg/L酵母細(xì)胞壁多糖浸浴96h后, 再加入 0.15 mg/L H2S浸浴12h后, 實驗D組蝦體內(nèi)鰓和肝臟中ACP酶活力與沒有浸浴過H2S的B組相比基本沒有差異, 即與B組的ACP酶活力大小近似, 仍明顯高于對照組(<0.05); 而與未經(jīng)酵母細(xì)胞壁多糖浸浴的C組相比, 則顯著差異(<0.05), 即D組肝臟和鰓組織中的ACP酶活力均顯著大于C組。這表明在H2S污染存在的情況下, 酵母細(xì)胞壁多糖仍然能明顯提高羅氏沼蝦鰓和肝臟中ACP酶活力。

2.2 酵母細(xì)胞壁多糖和H2S對羅氏沼蝦鰓、肝臟中POD酶活力的作用

表2顯示羅氏沼蝦肝臟中的POD酶活力比鰓中的強。經(jīng)酵母細(xì)胞壁多糖浸浴處理后, B組蝦體內(nèi)鰓和肝臟中POD酶活力明顯提高, 且均與對照組(A)有顯著差異 (<0.05), 尤其是肝臟中POD酶活力增加更明顯, 增達(dá)(19.521±0.687) U/mL。結(jié)果表明酵母細(xì)胞壁多糖能明顯提高羅氏沼蝦鰓和肝臟中POD酶活力。

純水浸浴96h后, 加入0.15 mg/L H2S浸浴12h后, 與對照組相比, C組蝦體內(nèi)鰓中POD酶活力明顯下降, 且與對照組有顯著差異 (<0.05), 但是肝臟中POD酶活力卻明顯提高(<0.05)。結(jié)果表明0.15 mg/L H2S能明顯降低羅氏沼蝦鰓中POD酶活力。

酵母細(xì)胞壁多糖浸浴96h后, 再加入H2S浸浴12h后, 蝦體內(nèi)鰓和肝臟中POD酶活力變化有差異。D組蝦體內(nèi)鰓和肝臟中POD酶活力與沒有H2S的實驗B組相比雖然有明顯下降, 但仍明顯高于對照組(<0.05); 而與未經(jīng)酵母細(xì)胞壁多糖浸浴的C組相比, 則實驗D組鰓中的POD酶活力明顯大于C組, 顯著差異(<0.05), 但是肝臟中的POD酶活力與C組相比卻差異不顯著。結(jié)果表明在H2S污染存在的情況下, 酵母細(xì)胞壁多糖仍然能明顯提高羅氏沼蝦鰓中的POD酶活力。

表2 酵母細(xì)胞壁多糖和硫化氫作用下羅氏沼蝦的POD酶活力(Mean ±SD)

2.3 酵母細(xì)胞壁多糖和H2S對羅氏沼蝦鰓、肝臟中PPO酶活力的作用

由表3可知, 羅氏沼蝦肝臟中的PPO酶活力比鰓中的強, 經(jīng)酵母細(xì)胞壁多糖和H2S單獨或共同浸浴處理后, 各實驗組羅氏沼蝦鰓和肝臟組織中的PPO酶活力均發(fā)生了變化。經(jīng)酵母細(xì)胞壁多糖浸浴處理后, B組蝦體內(nèi)鰓和肝臟中PPO酶活力明顯提高, 且均與對照組有顯著差異 (<0.05), 尤其是肝臟中PPO酶活力增加更明顯, 增加為(7.967±0.462) U/mL。這表明酵母細(xì)胞壁多糖能明顯提高羅氏沼蝦鰓和肝臟中PPO酶活力。而經(jīng)H2S浸浴處理后, C組蝦體內(nèi)鰓和肝臟中PPO酶活力明顯下降, 且均與對照組有顯著差異 (<0.05), 尤其是肝臟中PPO酶活力下降更加明顯。結(jié)果表明0.15 mg/L H2S能明顯降低羅氏沼蝦肝臟和鰓中PPO酶活力。在經(jīng)酵母細(xì)胞壁多糖浸浴96h后, 再加入H2S浸浴12h后, D組蝦體內(nèi)鰓和肝臟中PPO酶活力與沒有浸浴過H2S的B組相比基本沒有差異, 仍明顯高于對照組(<0.05); 而與未經(jīng)酵母細(xì)胞壁多糖浸浴的C組相比, 則顯著差異(<0.05), 即實驗D組肝臟和鰓組織中的PPO酶活力均顯著大于C組。結(jié)果表明在H2S污染存在的情況下, 酵母細(xì)胞壁多糖仍然能明顯提高羅氏沼蝦鰓和肝臟中PPO酶活力。

表3 酵母細(xì)胞壁多糖和硫化氫作用下羅氏沼蝦的PPO酶活力(Mean±SD)

3 討論

近年來國內(nèi)外已經(jīng)開始從分子水平對蝦類自身的防御機(jī)制展開研究, 蝦類的一些免疫抗病相關(guān)因子已被研究, 已知蝦體內(nèi)存在眾多的抗病因子(如各種水解酶類、氧化酶類、溶菌酶、酶激活劑、酶抑制劑、細(xì)胞因子、抗菌肽、溶血素、凝集素等), 它們具有相當(dāng)?shù)目共∧芰7, 8]。在蝦類免疫系統(tǒng)中, ACP、POD和PPO占有重要的地位。PPO在蝦類防御體外物質(zhì)入侵過程中, 伴隨顆粒細(xì)胞的脫顆粒和酚氧化酶原的激活被釋放, 酶活化后可以迅速黏附到異物表面, 以便達(dá)到識別和調(diào)理的功能[14]。ACP在甲殼動物體內(nèi)作為巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)志酶, 是溶酶體的重要組成部分, 在血細(xì)胞進(jìn)行吞噬和包囊反應(yīng)中, 會伴隨有酸性磷酸酶的釋放, 可通過水解作用將表面帶有磷酸酯的異物破壞或降解[7]。POD可以有效清除代謝活動中所產(chǎn)生的活性氧等毒性物質(zhì), 減輕其對細(xì)胞的損傷, 從而提高機(jī)體的機(jī)體防御和解毒功能[7]。因此不少學(xué)者認(rèn)為ACP、POD和PPO酶活力是判斷蝦類機(jī)體免疫能力的指標(biāo)之一。

本研究通過對不同實驗處理組蝦體鰓和肝臟組織中ACP、POD、PPO 3種免疫相關(guān)酶活性的分析比較, 初步分析了酵母細(xì)胞壁多糖和H2S對羅氏沼蝦免疫系統(tǒng)的影響。實驗結(jié)果表明, 經(jīng)125 mg/L的酵母細(xì)胞壁多糖浸浴108h后, 羅氏沼蝦的鰓和肝臟組織中的ACP、POD、PPO等3種免疫酶活力都能明顯增強。即酵母細(xì)胞壁多糖是一種對羅氏沼蝦免疫系統(tǒng)有促進(jìn)作用的免疫增強物質(zhì), 可以顯著增強羅氏沼蝦的免疫抗病能力。而在較高濃度H2S (0.15 mg/L)污染存在的情況下, 預(yù)先經(jīng)125 mg/L的酵母細(xì)胞壁多糖浸浴處理過的羅氏沼蝦與沒有經(jīng)酵母細(xì)胞壁多糖浸浴的羅氏沼蝦相比, 其鰓中ACP、POD、PPO酶活力和肝臟中ACP、PPO酶活力均顯著高于后者的。即表明在H2S污染存在的情況下, 酵母細(xì)胞壁多糖仍然能明顯提高羅氏沼蝦鰓ACP、POD、PPO酶活力和肝臟中ACP、PPO酶活力。這說明酵母細(xì)胞壁多糖能夠在一定程度上抑制H2S這種環(huán)境因子所造成的羅氏沼蝦體內(nèi)免疫功能下降的破壞作用, 消除其對羅氏沼蝦機(jī)體的危害, 增強羅氏沼蝦抵御外來異物的免疫能力。這與已有研究結(jié)論相類似, 如胡俊茹等[15]報道在南美白對蝦的飼料中添加100 mg/kg Bm的免疫多糖(酵母細(xì)胞壁), 發(fā)現(xiàn)其肝胰腺中的ACP和POD活性都極顯著地升高, 且增強了其抗哈維弧菌感染的能力。Sung,.[16]用從酵母菌細(xì)胞壁中提取的β-1, 3-葡聚糖的懸浮液浸泡斑節(jié)對蝦(), 發(fā)現(xiàn)18d內(nèi)蝦體內(nèi)的PPO的活性明顯上升, 且對蝦抵抗創(chuàng)傷弧菌()的能力增強了。Chang,.[17]用含有適量β-葡聚糖的飼料來喂養(yǎng)草魚, 結(jié)果表明含有適量β-葡聚糖的飼料可顯著改善其超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PPO)等免疫指標(biāo)的活性。Steiner,.[18]發(fā)現(xiàn), 酵母葡聚糖可提高大西洋大麻哈魚巨噬細(xì)胞內(nèi)溶菌酶的產(chǎn)量。

綜上所述, 酵母細(xì)胞壁多糖作為一種免疫激活劑, 對羅氏沼蝦免疫系統(tǒng)有明顯促進(jìn)作用, 且對H2S這種環(huán)境因子所造成的羅氏沼蝦免疫下降有一定的抑制作用, 從而可以顯著增強羅氏沼蝦的免疫抗病能力。因此, 在沼蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中除了要對養(yǎng)殖水體的H2S濃度進(jìn)行實時監(jiān)控, 并采取相應(yīng)的措施來減少或消除水體中的H2S, 還可考慮通過適量添加酵母細(xì)胞壁多糖等免疫激活劑來降低H2S對沼蝦的免疫破壞作用。

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Effects of yeast cell wall polysaccharides and H2S on the activities of three immune enzymes of

XU Yan, YU Jing, WANG Fang and ZHANG Dan-Feng

(College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

Yeast cell wall polysaccharide; Hydrogen sulfide;; Acid phosphatase; Peroxidase; Phenoloxidase

2012-12-18;

2013-11-17

上海師范大學(xué)科研項目(SK201112); 上海師范大學(xué)校級重點學(xué)科項目(DZL808)資助

許燕(1962—), 女, 浙江嘉興人; 副教授, 博士; 研究方向為甲殼動物學(xué)生理生化。E-mail: xuyan6@shnu.edu.cn

S945.4

A

1000-3207(2014)02-0382-04

10.7541/2014.54