斑馬魚HO1基因的表達特征及功能研究

陶文庭 王琳琳 侯少豐 李 志 桂建芳 鐘雪萍

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斑馬魚1基因的表達特征及功能研究

陶文庭1王琳琳1侯少豐1李 志2桂建芳2鐘雪萍1

(1. 華中師范大學生命科學學院, 湖北省遺傳調控與整合生物學重點實驗室, 武漢 430079; 2. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072)

實驗對血紅素加氧酶1(HO1)在斑馬魚發(fā)育中的功能進行了研究。多重序列比對結果顯示, 斑馬魚HO1與哺乳類、鳥類及其他魚類的HO1氨基酸序列的總體相似性為44.1%—86.8%, 血紅素結合標簽相似性為87.5%—95.8%。對斑馬魚早期胚胎和成魚各組織進行RT-PCR檢測, 結果顯示1轉錄本母源存在,1mRNA的表達水平在尾芽期前較低, 到咽囊期迅速上升并穩(wěn)定在較高水平。1基因在斑馬魚成魚多個組織中均有表達, 在肝臟、脾、鰓、腎中的表達量較高。WISH結果顯示,1基因在斑馬魚胚胎的卵黃合胞層、眼和血液中的表達量較高。利用超表達和基因敲降技術發(fā)現(xiàn), 注射1 mRNA使1基因過表達對斑馬魚早期胚胎發(fā)育無明顯影響。注射1MO使1基因表達抑制可導致斑馬魚胚胎出現(xiàn)發(fā)育遲緩、圍心腔水腫、尾部消失等不同程度的畸形。1 MO導致的斑馬魚胚胎發(fā)育異常可被1 mRNA回復。利用Real-Time PCR研究發(fā)現(xiàn),1基因表達抑制可導致1表達量顯著下降,1表達量顯著升高。這些結果表明斑馬魚1基因可通過調節(jié)IGF信號途徑調控胚胎的正常發(fā)育。

斑馬魚; 血紅素加氧酶1; 表達特征; 功能

血紅素加氧酶(Heme oxygenase, HO)是血紅素降解的起始酶和限速酶, 可代謝血紅素形成膽綠素、一氧化碳(CO)和游離鐵(Fe2+)。膽綠素被胞內的膽綠素還原酶進一步催化生成膽紅素。HO通過催化血紅素降解產生的代謝產物在抗氧化、防御細胞凋亡、傳遞神經元信息和調節(jié)血管緊張度等方面發(fā)揮重要作用[1-3]。HO在體內有3種同工酶, HO1、HO2和HO3, 分別由不同的基因編碼。研究表明, HO2和HO3為結構型, HO1為誘導型。當細胞和組織處于應激狀態(tài)時, HO1可作為保護性蛋白被誘導, 以防御體內由細胞因子介導的細胞損傷[3-7]。

研究發(fā)現(xiàn), 在產前驚厥和胎兒宮內發(fā)育遲緩的人類病人胎盤內HO1水平明顯降低[8, 9]。1基因缺失男孩生長發(fā)育異常, 伴有貧血、組織性鐵沉積、白血病, 并且對氧化損傷的敏感性增加, 直至最后死亡[10, 11]。大鼠體內HO1水平降低也表現(xiàn)出與1基因缺失男孩相似的病理反應[12, 13]。此外, 抑制大鼠胎盤的HO1活性導致胎兒個體顯著減小, 妊娠大鼠轉染1基因后胎兒的體重明顯增加[14]。Homx1-/-鼠仔存活率僅20%, 極少存活到成年的Homx1-/-小鼠個體較對照小。這些結果顯示, HO1在人和脊椎動物的發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要作用。

目前, 國內外研究主要探討了HO1在疾病的發(fā)生、發(fā)展和臨床治療中的作用, 而其在胚胎發(fā)育中的作用機制尚不清楚。斑馬魚具有胚胎體外發(fā)育,且胚胎透明的優(yōu)勢, 可直接在體外觀察其組織、器官的生長, 且便于基因操作。利用斑馬魚這一理想的發(fā)育和遺傳研究模型, 可系統(tǒng)地分析1基因的生物學功能。在本文中我們研究了斑馬魚1基因的時空表達特征, 然后通過基因過表達和敲降的方法初步研究了1在斑馬魚胚胎發(fā)育中的功能。

1 材料與方法

1.1 HO1的原核表達及多克隆抗體的制備

根據斑馬魚1 cDNA ORF序列設計一對引物1F1和1R1, 在5′端分別加入了I和Ⅰ的酶切位點序列(表1)。以cDNA 為模板, 用高保真酶進行PCR反應, 產物插入表達載體pET-32a, 陽性克隆用IPTG誘導重組蛋白表達。將誘導的蛋白進行SDS-PAGE分析, 用干凈的刀片準確切下目的條帶, 用生理鹽水研磨膠條成稀糊狀, 調整好濃度免疫家兔, 間隔免疫4次, 收集血液得到多抗血清。

1.2 RT-PCR和Real-time PCR檢測基因的表達

用SV Total RNA Isolation Kit (Promega)提取斑馬魚成魚各組織和各時期胚胎的總RNA, 具體步驟按照試劑盒說明書進行。取各組織或各時期胚胎RNA, 用逆轉錄酶Powerscrit和oligo(dT)合成第一鏈模板cDNA。用各種組織或胚胎的cDNA作為模板進行RT-PCR和Real-Time PCR反應。以斑馬魚基因作為對照。RT-PCR反應條件為: 95℃變性30s; 55℃退火30s; 72℃延伸30s。Real-time PCR體系: cDNA模板1 μL, 10×酶反應buffer 2 μL, dNTP (10 mmol/L) 0.4 μL, 上、下游引物各0.4 μL, SYBR Green I 1 μL,酶0.5 μL, 補ddH2O至20 μL。Real-time RCR循環(huán)程序與常規(guī)PCR相同, 只是在每一個循環(huán)最后要設一個讀板溫度, 這一般根據目的基因情況而定, 另一個要設的是融鏈溫度分析的梯度溫度。每一個樣品重復3次, 每個基因的表達量以為參照用2–??Ct方法[15]進行數據處理及分析。

1.3 整體原位雜交

參照斑馬魚的整體原位雜交方法[16]進行。所有雜交所用的溶液和移液管都用DEPC處理。

1.4 斑馬魚HO1 mRNA 體外合成與顯微注射

設計一對引物F4和R4 (表1)。以斑馬魚cDNA為模板, PCR擴增1基因的ORF序列。將該序列連接到pCS2+表達載體上, 測序確定其正確性和完整性。重組質粒經Ⅰ單酶切線性化后作為模板, 用Megascript試劑盒(Ambion公司)參照說明書合成Capped1 mRNA。使用顯微注射儀(PLI-100, 美國Harvard公司)進行顯微注射, 將mRNA注射入1細胞期斑馬魚胚胎的動物極細胞與卵黃的連接處。試驗組注射合成的Capped1 mRNA, 每個受精卵大約注射200 pg。對照組胚胎注射雙蒸水。實時觀察胚胎的表型變化并拍照。

1.5 斑馬魚HO1 Morpholino的合成與顯微注射

對1基因的序列進行分析, 采用在翻譯水平上進行封閉抑制基因的表達。將1的5′UTR 序列+翻譯起始位點ATG之后的一段序列提交至www.genetools.com, 設計并合成1基因的Mor- pholino (5′-TCCATCTTTGTGCTGTAGATGTCCT-3′)及其對照Morpholino (5′-TCCATGTTTCTGCTCTAC ATCTCCT-3′)。于l-細胞期將Morpholino和對照Morpholino注射到受精卵動物極細胞與卵黃的連接處, 每個受精卵大約注射5 ng, 實時觀察胚胎的表型變化、拍照并在適當時間收集胚胎。

1.6 Western blotting 檢驗HO1蛋白的表達

取對照組或顯微注射1 mRNA/MO的胚胎。參照斑馬魚胚胎免疫印跡方法[17]進行檢測各組HO1蛋白的表達。

1.7 觀察、測量和數據統(tǒng)計

顯微注射后的斑馬魚胚胎用體視顯微鏡進行觀察、拍照。用ImageJ 4.1軟件測量照片上胚胎的體長及頭身角(HTA)。組間數據用Origin 6.1軟件中-test方法來分析差異顯著性。測量數據用Means ± standard error (SE)的圖形來表示。當<0.05時認為差異性顯著。

表1 實驗所用引物

2 結果

2.1 斑馬魚HO1基因的序列同源性以及進化樹分析

從NCBI查得斑馬魚的1基因序列。根據DNAstar軟件獲得DrHO1氨基酸序列, 利用在線軟件預測出DrHO1的結構。預測的DrHO1結構與哺乳類HO1結構基本相似, 含有血紅素加氧酶結構域(Heme oxygenase domain)和血紅素結合標簽(Heme oxygenase signature)。用ClustalW進行序列比對, 結果顯示DrHO1氨基酸序列與哺乳類、鳥類及其他魚類的HO1氨基酸序列的總體相似度為44.1%—86.8%, 血紅素加氧酶結構域相似度為50.2%—88.8%, 結構域中血紅素結合標簽相似度為87.5%—95.8% (表2)。在目前已經發(fā)現(xiàn)的魚類HO1中, 斑馬魚HO1與CaHO1相似性最高, 為86.8%。用DNAStar構建系統(tǒng)進化樹(圖1), 發(fā)現(xiàn)人和各種動植物的HO蛋白, 按照HO不同的類型嚴格聚類。斑馬魚的HO1則與其他魚類的HO1聚集到一個分支上。而各種動物的HO1和HO2聚類在同一個分支上, 較BjHO3同源性更高。

表2 斑馬魚HO1與其他物種HO1的同源性比較

圖1 HO家族的系統(tǒng)進化關系

Bj.; Bt.; Ca.; Dl.; Dr.; Gg.; Hs.; Mam.; Mm.; Rn.; Tr.; Xt.

2.2 HO1基因在斑馬魚胚胎以及成魚各組織中的分布

RT-PCR結果顯示,1轉錄本是母源存在的,1基因的表達水平在尾芽期以前比較低, 從分節(jié)期開始上升, 到咽囊期迅速上升到較高水平, 該基因的高水平表達一直持續(xù)到胚胎出苗(圖2)。用1反義RNA探針對不同發(fā)育時期的胚胎進行整體原位雜交實驗。WISH結果顯示,1基因在斑馬魚胚胎的卵黃合胞層、眼和血液中的表達量比較高(圖3)。用RT-PCR檢測1基因的組織分布, 結果顯示1基因在斑馬魚所檢測的各個組織中均有表達, 在肝臟、脾、鰓、腎、腦中的表達量較大, 在皮膚和肌肉中也檢測到痕量的轉錄本(圖4)。

2.3 超表達HO1基因對斑馬魚早期胚胎發(fā)育無明顯影響

將體外合成的斑馬魚1 mRNA 注射斑馬魚胚胎, 使1基因超表達, 觀察其表型變化。同時用注射H2O的斑馬魚胚胎作為對照組。采用Western blot檢驗mRNA的特異性, 發(fā)現(xiàn)體外合成的1 mRNA 可以特異增加HO1的表達量(圖5A)。實驗結果顯示, 顯微注射1 mRNA, 使1基因超表達后, 斑馬魚胚胎的表型沒有明顯變化(圖5B)。

圖2 RT-PCR檢測HO1基因在不同胚胎發(fā)育階段的表達特征

1.Unfertilized; 2. 2 hpf; 3. 4 hpf; 4. 6 hpf; 5. 10 hpf; 6. 24 hpf; 7. 36 hpf; 8. 48 hpf; 9. 60 hpf; 10. 72 hpf

圖3 WISH分析HO1基因在不同胚胎發(fā)育階段的表達

圖4 HO1在斑馬魚組織里的表達特征圖譜

1. 心heart; 2. 肝liver; 3. 脾splee; 4. 腮gill; 5. 腎kidney; 6. 腦brain; 7. 精巢testis; 8. 皮膚skin; 9. 肌肉muscle

2.4 敲降HO1 基因導致斑馬魚胚胎發(fā)育異常

采用Western blot檢驗MO的特異性, 發(fā)現(xiàn)MO可以特異性地降低HO1蛋白的表達(圖6A)。我們用斑馬魚1 的特異 morpholino (1-MO) 注射斑馬魚胚胎, 使1基因敲降。并用斑馬魚1 MO 和體外轉錄合成的斑馬魚1 mRNA共注射斑馬魚胚胎。同時用注射對照morpholino (Control-MO)的斑馬魚胚胎作為對照組。在體視顯微鏡下觀察24、36和48 hpf各組胚胎表型變化。實驗結果表明,顯微注射1 MO, 在1基因敲降后, 斑馬魚胚胎較對照發(fā)育遲緩, 圍心腔水腫。嚴重畸形的胚胎軀干縮短, 尾部消失。1 MO和mRNA共注射組胚胎表型沒有發(fā)生明顯變化(圖6B、C)。敲降組胚胎畸形率和死亡率明顯高于對照組, 而共注射組胚胎畸形率和死亡率基本與對照組沒有明顯差異(圖6D)。

取顯微注射后48h的胚胎, 利用Real-time PCR 技術, 以11 和1等基因為研究對象, 探討了1基因敲降對IGF信號通路的影響。結果發(fā)現(xiàn),1基因敲降組斑馬魚胚胎1的表達量較對照組顯著下降,1的表達量較對照組顯著增加,表達量無顯著變化(圖7)。

3 討論

目前有關1基因的研究比較多, 但國內外尚無斑馬魚1基因在胚胎發(fā)育中的功能的報道。生物信息學分析表明, 斑馬魚1基因序列具有HO1的主要功能區(qū), 包含保守的血紅素加氧酶結構域、血紅素結合標簽、C端跨膜區(qū)(252—271aa)以及5個組氨酸殘基(His28、His74、His98、His115、His135)。血紅素加氧酶是催化血紅素降解的起始酶和限速酶, 血紅素結合標簽和保守的組氨酸殘基有助于血紅素結合在血紅素加氧酶上, 使血紅素加氧酶發(fā)揮催化作用。多重序列比對分析發(fā)現(xiàn), 斑馬魚HO1氨基酸序列相對保守, 與小鼠、人、雞、兔子、斑馬魚、鯽魚、河豚等1基因的同源性為44.1%—86.8%。斑馬魚1基因血紅素結合標簽與其他物種的同源性高達87.5%以上。這些分析表明1基因在生物進化過程中具有重要的生物學功能。

圖5 斑馬魚HO1基因過表達表型分析

A. 免疫雜交檢測注射1 mRNA后HO1的蛋白水平; B.1過表達表型

A. Western blot analysis of1 protein in embryos after1 mRNA injection; B. Phenotype of zebrafish embryos injected with1 mRNA

圖6 HO1基因敲降對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

A. Western blot檢測注射MO后HO1的蛋白水平; B.1敲降胚胎表型; C.1敲降胚胎頭身角測量; D. 三種不同表型胚胎的百分比, 白色柱代表正常胚胎, 灰色柱代表畸形的胚胎, 黑色柱代表死亡的胚胎

A. Western blot analysis of HO1 protein in embryos after1 MO injection; B. Phenotype of zebrafish embryos injected with1 MO; C. HTA of zebrafish embryos injected with1 MO; D. Percentage histogram of three phenotypes, including normal (white bar), abnormal (grey bar) and dead (dark bar) embryos

圖7 Real-Time PCR檢測斑馬魚HO1敲降后IGF1、IGFR1和IGFBP1 的mRNA 水平

HO1在脊椎動物胚胎發(fā)育過程中具有明顯的時空表達差異和細胞特異性。研究發(fā)現(xiàn), 大鼠個體發(fā)生過程中HO1的表達最先出現(xiàn)在懷孕10d大鼠的卵黃囊未成熟巨噬細胞內, 隨后出現(xiàn)在胚胎的肝臟巨噬細胞。隨著胎兒的發(fā)育, 表達HO1的巨噬細胞數目不斷增加, 到孕后18d達到頂峰。HO1在胎兒肝、肺、脾、骨髓和其他組織的巨噬細胞, 以及絨毛膜的合胞層細胞、卵黃囊的內胚層細胞、腎小管細胞中也有表達[8-20]。斑馬魚的原位雜交結果表明, 胚胎發(fā)育期間斑馬魚1基因在卵黃合胞層、血液和眼中被檢測到, 與小鼠的結果非常相似。RT-PCR結果表明, 從未受精卵開始, 即可以檢測到斑馬魚1基因的表達, 說明斑馬魚1基因是母源表達基因。母源表達基因可以調控早期胚胎的細胞分裂、細胞分化和合子基因轉錄的起始。這表明HO1在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

進一步對斑馬魚1在成體各組織中的表達情況進行分析, 發(fā)現(xiàn)1基因在多個組織中均有表達, 表達量有顯著的組織差異。1作為早期壓力應答基因, 在生理條件下廣泛表達。而高水平1的表達主要發(fā)生在一些降解衰老紅細胞的組織中, 在很多不參與紅細胞和血紅蛋白轉化的組織表達量較低[4]。研究發(fā)現(xiàn)在脊椎動物被檢測的多個組織中脾內1的含量最高, 其次為肝[21, 22]。1在腦中的表達因物種的不同會有差異。和小鼠腦中1的表達量在所有檢測的組織中最低[23]。而我們的結果表明,1基因在斑馬魚多個組織中均有表達, 在肝臟、脾、鰓、腎、腦中的表達量均較大, 僅在皮膚和肌肉中表達量較小。這些結果表明HO1在斑馬魚成年組織器官中可能具有更廣泛的生物學功能。

近年來顯微注射嗎啡啉修飾反義寡核苷酸(MO)阻抑基因表達已被廣泛用于研究魚類目的基因的功能。我們設計的1 MO在靶基因的翻譯起始點ATG附近。Western blot結果顯示, 顯微注射1 MO后HO1蛋白的表達量顯著降低, 表明1 MO能有效的阻斷1基因的表達。與對照組相比,1 MO注射組胚胎發(fā)育遲緩, 圍心腔水腫。嚴重畸形的胚胎軀干縮短, 尾部消失, 且死亡率和畸形率大大增加。1 MO所引起的異常表型可被1 mRNA回復。這一結果表明1基因表達異常可顯著影響斑馬魚正常發(fā)育。人類和哺乳動物中的研究表明, HO1主要通過增加胎兒胎盤的血流量, 增強胎盤生長因子(如VEGF等)的表達和激活, 從而調節(jié)胚胎的早期發(fā)育[12, 24—26]。斑馬魚為卵生動物,1基因調節(jié)其胚胎發(fā)育的方式與哺乳動物不同,1基因可直接調節(jié)胚胎各器官的發(fā)育。我們的研究發(fā)現(xiàn),1基因表達量降低可影響胚胎生長發(fā)育重要調節(jié)基因1和1的正常表達, 導致1的表達量較對照組顯著下降,1的表達量較對照組顯著增加, 表明斑馬魚1 基因可通過調節(jié)胚胎IGF信號途徑調控胚胎的正常發(fā)育。

總之, 斑馬魚1是母源基因, 在斑馬魚胚胎正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用。但目前HO1在斑馬魚胚胎發(fā)育中的作用方式和作用機制尚不清楚。本研究為進一步探討斑馬魚HO1影響斑馬魚早期胚胎發(fā)育的機制奠定了基礎。

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STUDY ON EXPRESSION PATTERN AND FUNCTION OF ZEBRAFISH1

TAO Wen-Ting1, WANG Lin-Lin1, HOU Shao-Feng1, LI Zhi2, GUI Jian-Fang2and ZHONG Xue-Ping1

(1. Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, College of Life Sciences, Huazhong Normal University, Wuhan 430079, China; 2.State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

This paper has studied the function of heme oxygenase 1 (HO1) in the development of zebrafish. Zebrafish1contains heme oxygenase domain, heme binding signature, five histidine residues and hydrophobic segment at carboxyl terminus. Analysis of the deduced amino acid sequences revealed zebrafish1shared 44.1%—86.8% similarity with known sequences from other species. Analyzing embryos of different development stages by RT-PCR showed that zebrafish1 existed in unfertilized eggs. Its level increased from 24hpf and remained a high level expression until 72hpf. The tissue expression pattern analysis showed that zabrafish1 was expressed ubiquitously and the expression in brain, heart, gill and liver was obviously higher than others. Whole-mounthybridization showed that1 transcript exists in yolk syncytial layer, blood and eyes during embyonic development. Using overexpression and knock down technology, we found that over-expression of1 had no apparent effect on the early development of zebrafish. Knocked down of1 gene by1 MO made the embryo development retarded. The abnormality and lethal rates of embryos after MO treatment were significantly increased compared with control. The level of1 and1mRNA changed significantly after1 was knocked down. These results showed that HO1 can regulate of zebrafish embryonic development through IGF signaling.

Zebrafish; Heme oxygenase 1; Expression pattern; Function

2013-04-24;

2014-01-12

國家自然科學基金項目(30972254, 31071997); 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室開放基金(2013FB03)資助

陶文庭(1986—), 湖北武漢人; 碩士研究生; 研究方向為遺傳學。E-mail: taowenting929@163.com

桂建芳, E-mail: jfgui@ihb.ac.cn; 鐘雪萍, E-mail: zhongxueping@mail.ccnu.edu.cn

Q344+.1

A

1000-3207(2014)02-0209-07

10.7541/2014.31