實時熒光定量PCR檢測皺紋盤鮑Δ5脂肪酸去飽和酶基因表達方法的建立及應用

李明珠 麥康森 何 艮 艾慶輝 徐 瑋 張文兵

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實時熒光定量PCR檢測皺紋盤鮑Δ5脂肪酸去飽和酶基因表達方法的建立及應用

李明珠 麥康森 何 艮 艾慶輝 徐 瑋 張文兵

(中國海洋大學水產動物營養與飼料農業部重點實驗室, 海水養殖教育部重點實驗室, 青島 266003)

研究以皺紋盤鮑(Ino)體內存在的2條Δ5(1和2)為目的基因,肌動蛋白(-actin)和核糖體蛋白S9(Ribosomal protein S9,9)為內參基因, 應用2–ΔΔCt方法建立了實時熒光定量PCR (Real-Time quantitative PCR, RT-qPCR)檢測體系, 并應用此體系分析了鮑魚肌肉組織Δ5在不同飼料處理下的表達差異。實驗飼料含有不同的脂肪源, 分別是棕櫚酸甘油酯(Tripalmitin, TP飼料)、富含二十碳四烯酸(Arachidonic acid, ARA)的油脂(AO飼料)和富含二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)的油脂(EO飼料)。結果表明: 針對1、2、-actin和9所設計的引物特異性強。各引物對的PCR擴增效率(Efficiency,)分別為1.05、0.99、0.97和0.98, 滿足2–ΔΔCt方法對的要求。當退火溫度為 52℃, 反應體積為25 μL時, RT-qPCR的擴增效果最好。所建立的體系能夠準確定量Δ5的基因表達。利用該方法分析Δ5在不同飼料處理下的表達結果顯示, 與TP對照組相比, EO和AO飼料顯著降低了鮑魚肌肉組織Δ5(1和2)的表達量。

脂肪酸去飽和酶; 鮑魚; 實時熒光定量PCR; 基因表達

實時熒光定量PCR (Real-Time quantitative PCR, RT-qPCR)技術是由美國應用生物系統公司Applied Biosystems (ABI)于1996年發明, 是指在PCR的每一個循環中連續檢測熒光信號的強弱來即時獲知特異性擴增產物的量, 并據此來計算初始模板的量[1]。對于一個特定的PCR來說, 隨著DNA不斷擴增, 熒光信號強度也不斷增強, 當熒光信號增強到超過閾值時, 熒光擴增曲線會和閾值線有個交點, 這個交點的橫坐標就是值, 而原始模板量的大小正是由值來反應的[2, 3]。基因定量方法包括絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過標準曲線來確定目的基因的絕對拷貝數[4]。該方法的優點是可以清楚確定基因的絕對拷貝數, 缺點是過程復雜、耗時且成本高[5]。在很多情況下, 實驗要求并不需要確定轉錄本的絕對拷貝量, 而只需要給出相對基因表達差異即可, 即相對定量。相對定量包括雙標準曲線法、2–ΔΔCt和動力學法等。由于系統誤差的原因, 不同的樣品很難獲得相同量的RNA, 這時就有必要引入內參基因來對所有樣品進行歸一化處理, 然后再對不同樣品之間的目的基因表達量進行比較[6]。目前, 比較常用的相對定量的方法是２–ΔΔCt法, 此法已經被廣泛應用于基因表達的相對定量分析中[7]。應用此法需要引入合適的內參基因, 且目的基因和內參基因的引物設計要求也較高[8]。因此, 在用此方法確定某一基因的表達量之前, 建立和優化該基因的RT-qPCR檢測體系, 具有十分重要的意義。

脂肪酸去飽和酶(Fatty acyl desaturase,)和延長酶是動物體內合成長鏈多不飽和脂肪酸(Long- chain polyunsaturated fatty acid, LC-PUFA)的關鍵酶。近年來, Δ6和延長酶在許多水產動物, 尤其是在海水魚類中得到廣泛研究[9—13]。然而, 關于Δ5基因的研究較少, 這主要是由于在很多海水動物中沒有成功克隆到該基因[13—15]。最近研究表明硬骨魚類Δ5的基因在進化過程中喪失, 盡管Δ5去飽和活性在部分魚類中被保存下來[16]。越來越多的信息表明Δ5是研究動物體LC-PUFA合成能力的關鍵。最近我們成功克隆了2條皺紋盤鮑(Ino) Δ5的cDNA序列,1(GQ470626)和2(GQ466197)。DNAMAN軟件分析表明1和2的cDNA序列相似性高達96.82 %, 因此建立合適的基因表達檢測體系對于后期開展針對1和2的定量表達研究至關重要。本研究應用SYBR Green Ⅰ熒光染料, 通過2–ΔΔCt方法建立Δ5的RT-qPCR檢測體系并采用該體系分析不同脂肪源飼料對皺紋盤鮑Δ5基因表達量的影響。

1 材料與方法

1.1 養殖動物與實驗飼料

皺紋盤鮑稚鮑購買自青島鰲山衛鮑魚育苗場。使用海帶暫養1周后隨機分為3組, 每組3個重復, 每個重復50頭稚鮑[初始體質量為(0.38±0.01) g, 初始殼長為(15.06±0.21) mm]。以酪蛋白和明膠為蛋白源, 糊精和海藻酸鈉為糖源, 不同的油為脂肪源配制等氮等能的實驗飼料。其中三種不同的脂肪源分別為棕櫚酸甘油酯(Tripalmitin, TP)、富含二十碳四烯酸(Arachidonic acid, ARA)的油脂和富含二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)的油脂。三組實驗飼料分別命名為TP飼料、AO飼料和EO飼料。飼料成分測定: 粗蛋白用凱氏定氮法(N×6.25), 粗脂肪用索氏抽提法, 灰分用馬弗爐灰化法(550℃), 高效氣象色譜法測定飼料中各脂肪酸的相對含量(表1)。實驗在室內循環水系統中進行, 養殖周期120d。每天下午17:00—18:00投喂飼料, 投喂量為鮑體重的2%—5%, 投喂完畢將遮光布覆蓋在大桶蓋上。次日早7:00-8:00吸底清除殘餌糞便。養殖期間水溫為16.0—18.0℃, 鹽度為31‰—35‰, pH為7.5—8.0, 溶解氧>7 mg/L。每周刷桶清除桶壁上可能附著的藻類, 防止稚鮑刮食造成額外的脂肪酸攝入。

1.2 鮑魚肌肉組織總RNA提取與cDNA一鏈合成

用手術剪取養殖試驗前及養殖試驗后的鮑魚肌肉組織, 在液氮條件下迅速研磨成粉末。取小于0.1 g研磨好的肌肉組織放入加有1 mL TRIZOL reagent(Invitrogen)的1.5 mL無RNase離心管中, 充分反應5min。用TRIZOL試劑法提取肌肉組織中的總RNA, 并將提取的總RNA經DNase Ⅰ(TaKaRa)處理以除去RNA中可能存在的基因組DNA污染。NanoDrop?ND-1000 Spectrophotometer微量分光光度計測定RNA的質量和濃度, 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取1 μg RNA按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)說明書完成cDNA一鏈的合成, 保存于–20℃待用。

表1 實驗飼料配方以及成分組成

注:1維生素預混料 (/kg) : B1/硫胺素 Thiamin HCl, 120.0 mg; B2/核黃素 Riboflavin, 100.0 mg; 葉酸Folic acid, 30.0 mg; B6/砒哆素 Pyridoxine HCl, 40 mg; 煙酸/尼克酸 Niacin, 800 mg; 泛酸鈣 Ca pantothenate, 200 mg; 肌醇 Inositol, 4000; 生物素 Biotin, 12 mg; 維生素B12 Vitamin B12, 0.18 mg; 維生素C Ascorbic acid, 4000 mg; 維生素E Vitamin E, 450 mg; 維生素K3 Menadione, 80 mg; 維生素A Retinal acetate, 100000 IU; 維生素D Cholecalciferol, 2000 IU; 2礦物質預混料(/kg): NaCl, 0.4 g; MgSO4·7H2O, 6.0 g; NaH2PO4·2H2O, 10.0 g; KH2PO4, 12.8 g; Ca(H2PO4)2·H2O, 8.0 g; ZnSO4·7H2O, 141.2 mg; CoCl2·6H2O, 0.4 mg; KIO3, 1.2 mg; CuSO4·5H2O, 12.4 mg; Na2SeO3·5H2O, 0.4 mg; Fecitrate, 1.0 g

Note:1Vitamin mix (/kg): Thiamin HCl, 120.0 mg; Riboflavin, 100.0 mg; folic acid, 30.0 mg; Pyridoxine HCl, 40 mg; Niacin, 800 mg; Ca pantothenate, 200 mg; Inositol, 4000; Biotin, 12 mg; Vitamin B12, 0.18 mg; Ascorbic acid, 4000 mg; Vitamin E, 450 mg; Menadione, 80 mg; Retinal acetate, 100000 IU; Cholecalciferol, 2000 IU;2Mineral mix (/kg): NaCl, 0.4 g; MgSO4·7H2O, 6.0 g; NaH2PO4·2H2O, 10.0 g; KH2PO4, 12.8 g; Ca(H2PO4)2·H2O, 8.0 g; ZnSO4·7H2O, 141.2 mg; CoCl2·6H2O, 0.4 mg; KIO3, 1.2 mg; CuSO4·5H2O, 12.4 mg; Na2SeO3·5H2O, 0.4 mg; Fecitrate , 1.0 g

1.3 RT-qPCR檢測Δ5 Fad基因表達體系的建立與檢測

內參基因的選擇及定量引物的檢驗 在定量表達研究中, 一般是選擇表達量比較恒定的看家基因作為內參基因。內參基因與目的基因的特異性引物設計對于定量結果至關重要。首先, 要檢驗定量引物的特異性, 這需要通過分析RT-qPCR產物的熔解曲線。其次, 要驗證定量引物是否符合定量方法(2–ΔΔCt)對引物的要求。具體過程如下: 養殖試驗前鮑魚肌肉組織的cDNA模板經過梯度稀釋(4倍稀釋)以后得到一系列濃度梯度的模板, 對每一個稀釋模板, 都用目的基因和內參基因的定量引物進行擴增得到值, 每個模板重復三次。以Lg (相對模板拷貝數)為橫坐標, 以平均為縱坐標, 得到一條回歸直線。RT-qPCR反應的擴增效率(Efficiency,)可以從回歸直線上計算得到[=10(–1/斜率)–1]。然后以Lg (相對模板拷貝數)為橫坐標, 以平均Δ目的-內參為縱坐標, 建立目的基因和內參基因的模板濃度梯度稀釋擴增產物的Δ曲線。通過判斷Δ曲線的斜率絕對值來判斷目的基因和內參基因的是否一致[7]。

本研究選取皺紋盤鮑常用的兩種看家基因:肌動蛋白(-actin, AY380809)和核糖體蛋白S9(Ribosomal Protein S9, RPS9, EU247757)作為內參基因的候選進行驗證。根據已調取的皺紋盤鮑的1和2序列與兩種看家基因的序列, 利用Primer 5.0按照定量引物的要求分別設計特異性引物(表2)。所有引物委托上海生物工程有限公司合成。

表2 實時熒光定量PCR所用的特異性引物

退火溫度及反應體積的篩選 RT-qPCR反應條件中退火溫度設為52℃、50oC和48℃來進行實驗。基本反應條件為: 95℃預變性30s; 95℃變性5s, 退火15s, 72℃延伸20s, 延伸結束后收集熒光信號, 共35個循環。循環結束后加入溶解曲線程序: 95℃, 15s; 退火15s, 5min緩慢上升到95℃。確定最佳退火溫度后, 再摸索最佳PCR反應體積, 分為10、25和50 μL來進行實驗。反應液成分(以25 μL為例): SYBR?Premix ExTM(2×)12.5 μL; PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.5 μL; PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.5 μL; cDNA模板2 μL; dH2O up to 25 μL。

1.4 Hdhfad1和Hdhfad2 RT-qPCR表達量分析

在研究目的基因的表達之前, 我們首先要確定實驗處理對所選內參基因的表達會不會產生影響。具體方法是用2–ΔCt方法來進行計算, 其中Δ=(處理組內參)?(對照組內參)。目的基因受飼料處理表達的影響用2–ΔΔCt來表示, ΔΔ= Δ(處理組)?Δ(對照組), 其中Δ=(目的基因)?(內參基因)。TP處理組鮑魚作為對照組, AO和EO飼料喂養的鮑魚作為處理組。數據按照2–ΔΔCt法進行分析[7], 利用SPSS軟件中的Turkey法對所獲得的數據進行統計, 當<0.05時認為有顯著差異。

2 結果

2.1 肌肉組織總RNA質量檢驗

提取的總RNA, 28S和18S條帶清晰, 邊緣銳利。260/280值介于1.90到2.00之間, 證明所提取的總RNA質量良好, 符合實驗要求。

2.2 特異性引物的驗證以及內參基因的選擇

引物特異性驗證1、2、-actin和9基因的特異性引物PCR擴增產物溶解曲線全部為單峰, 說明擴增產物唯一, 沒有非特異性擴增和引物二聚體。這表明針對4個基因設計的4對引物特異性高, 滿足實時定量PCR對引物高特異性的要求。

目的基因與內參基因的擴增效率驗證 目的基因(1與2)與內參基因(-actin和9)的濃度梯度稀釋模板擴增標準曲線見圖1,值與cDNA模板相對拷貝數的對數呈負線性相關關系。標準曲線的回歸方程,2值和計算出的擴增效率值如下:1:= –3.20+ 31.32,= 0.997,=1.05。2:= –3.33+ 30.37,= 0.9998,=0.99。-actin:= –3.394+ 24.22,= 0.9999,=0.97。9:= –3.37+ 24.37,= 0.9999,=0.98。均接近1, 說明所有引物對擴增效率良好, 滿足條件。目的基因與內參基因一致性驗證結果見圖2。由圖2(A和B)可以看出, 目的基因1和2與-actin的Δ標準曲線的斜率分別為0.19和0.06, 與9的Δ標準曲線的斜率分別為0.16和0.03。斜率均接近0, 說明看家基因-actin和9與目的基因擴增效率一致, 滿足定量條件。

2.3 退火溫度與反應體積的確定

在不同退火溫度(52℃、50℃和48℃)反應條件下, 目的基因和內參基因的擴增條帶均唯一且清晰。在52℃條件下, 條帶最明亮且無雜帶說明退火溫度選52℃最為合適。不同反應體積(10、25和50 μL)各組條帶均明亮且無雜帶, 說明不同反應體積對PCR效果沒有顯著影響。根據PrimeScriptTMRT

圖1 目的基因(Hdhfad1和Hdhfad2)與內參基因(β-actin和RPS9)濃度梯度稀釋模板擴增標準曲線

圖2 目的基因(Hdhfad1和Hdhfad2)與內參基因β-actin(A)或RPS9(B)濃度梯度稀釋模板擴增產物的ΔCt標準曲線

2.4 SYBR Green Ⅰ RT-qPCR反應擴增曲線

從1(A)、2(B)、-actin(C)和9(D)基因熒光定量擴增曲線可以看出, 各基因擴增曲線拐點清楚, 指數期明顯, 擴增曲線平行性好, 基線無上揚現象。每一種基因的梯度模板擴增值間隔明顯, 重復性好。這說明RT-qPCR的反應體系合適、反應條件良好。

2.5 實驗處理對Hdhfad1與Hdhfad2表達量的影響

在研究目的基因的表達是否受實驗處理的影響時, 我們要選擇內參基因來歸一化所研究的目的基因, 這時首先要確定實驗處理對所選的內參基因表達不會產生影響。不同實驗飼料處理對候選內參基因表達量的結果(表3)表明僅有9可以用作內參基因來歸一化目的基因。實驗處理對1與2表達量的影響見圖3, 與對照組(TP)相比, AO和EO飼料顯著降低了1與2的表達。AO處理組鮑魚1和2的表達量分別是對照組鮑魚的(60.44±0.17)%和(68.04±0.12)%, EO處理組鮑魚1和的表達量分別是對照組鮑魚的(43.30±0.14)%和(68.39±0.10)%。

表3 實驗處理對稚鮑肌肉組織看家基因表達量的影響

注: 平均數后上標不同字母表示差異顯著(<0.05)

Note: Different letter represents significant difference (<0.05)

圖3 實驗處理對稚鮑肌肉組織Hdhfad1與Hdhfad2表達量的影響

星號代表此處理組基因表達量與TP處理組有顯著性差異

Asterisks represent significant differences (<0.05) between the column’s dietary treatment and the TP treatment, for the respective transcript

3 討論

LC-PUFA, 比如ARA、EPA或DHA, 是以亞油酸或者亞麻酸為底物, 經過Fad和延長酶的共同作用而生成的終產物。其中, Δ5是合成LC-PUFA的關鍵酶。兩種Δ5(和)在皺紋盤鮑中被成功克隆, cDNA全長序列分析顯示1和2的相似性高達96.82 %。因此, 建立一種快速、準確的Δ5的RT-qPCR檢測方法對后續研究皺紋盤鮑Δ5基因的表達至關重要[17]。2–ΔΔCt方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法[7]。在使用此方法時, 需要對內參基因以及設計的定量引物進行嚴格的檢驗, 否則會造成最終相對表達量結果的不準確[18]。本研究根據1和2序列的差異部分以及候選內參基因-actin和9的全長序列設計出特異性定量引物。RT-qPCR擴增產物的融解曲線表明所設計的定量引物具有很強的特異性。各引物對的擴增效率以及Δ模板梯度稀釋標準曲線的斜率表明所設計的特異性引物擴增效率一致且接近于1, 符合２–ΔΔCt定量方法的要求[7]。各組PCR的熒光擴增曲線良好, 表明所設定的PCR反應體系合適、反應條件良好。看家基因9的表達不受AO和EO飼料處理的影響, 適合作為內參基因來歸一化Δ5的表達。本實驗所選取的內參基因、設計的定量引物以及設定的RT-qPCR條件能夠準確并快速的檢測皺紋盤鮑Δ5(12)表達量的變化。

應用建立的方法對皺紋盤鮑Δ5(1和2)的表達水平進行檢測, 進一步證實了建立的SYBR Green I RT-qPCR 檢測方法的可靠性。與對照組(TP)鮑魚相比, 富含LC-PUFA的AO飼料和EO飼料顯著降低了鮑魚肌肉組織1和2的表達量。這與許多其他水產動物的研究結果是一致的。例如對鱸魚(L.)、虹鱒()、大西洋鮭魚()、鯉魚(var. Jian)和Jade Tiger hybrid 鮑魚(黑鮑× 綠鮑)的研究中發現, 與投喂植物油飼料組相比, 富含LC-PUFA的魚油飼料顯著降低了魚體肝臟組織中Δ6或Δ5的表達量[10, 19—24]。LC-PUFA對的表達具有反饋阻遏作用, 這或許對于整個家族的進化起到了一定的作用。有研究表明大部分海水性魚類(尤其是肉食性魚類), 由于長期攝食富含LC-PUFA的食物, 體內的Δ5基因在進化的過程中消失[13, 15, 16, 25]。然而, 在同樣的狀態下, Δ6卻在大多數物種中保存下來。Δ6是合成LC-PUFA的第一步作用酶也是限速酶。Δ6不僅在合成EPA的過程中發揮作用, 在由EPA合成DHA時也發揮了作用。因此, Δ6基因和酶活被保存下來可能與其能夠在合成LC-PUFA過程中發揮特定的生理功能有關系[16]。

目前已經證明鮑魚體內存在Δ6、延長酶和Δ5, 并且這些酶在mRNA水平上均受到飼料脂肪酸的影響[22—24]。本研究建立針對Δ5(1和2)的RT-qPCR檢測體系具有很好的靈敏性、重復性和簡便性。這為今后研究Δ5(1和2)受營養如何調控以及這種調控在動物體合成LC-PUFA的過程中起到多大的促進作用奠定了分子基礎。

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Establishment and application of Real-Time quantitative PCR reaction system for study in gene expression of Δ5 fatty acyl desaturase in abalone (Ino)

LI Ming-Zhu, MAI Kang-Sen, HE Gen, AI Qing-Hui, XU Wei and ZHANG Wen-Bing

(Key Laboratory of Aquaculture Nutrition and Feeds (Ministry of Agriculture), Key Laboratory of Mariculture (Ministry of Education), Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Δ5 fatty acyl desaturase () is the key enzyme for the biosynthesis of long chain polyunsaturated fatty acids. Abalone,Ino, has two genes of Δ5(1 and2), of which the cDNA sequences are highly similar (96.82 %). In this study, an efficient Real-Time quantitative RCR (RT-qPCR) assay based on the 2–ΔΔCtmethod was established for measuring the expression levels of1and2. Data were normalized to the gene expression levels of-actin and ribosomal protein S9 (9). The effects of different dietary lipids on the expressions of1 and2were studied in muscle tissue of abalone using this assay. We prepared three types of diets that contain different dietary lipids－tripalmitin (TP diet), ARA oil (AO diet) and EPA oil (EO diet). The results showed that primers designed for,,-actin and9 were specific,with the amplifying efficiency of 1.05, 0.99, 0.97 and 0.98 respectively. The efficiency of these primers was suitable for the 2–ΔΔCtmethod. The optimal annealing temperature and reaction volume for the RT-qPCR amplification were 52℃and 25 μL respectively. We concluded that this assay was rapid and sensitive in analyzing the expressions of Δ5in abalone. This assay demonstrated that the expression levels ofandwere significantly decreased in abalone fed with EO or AO diet compared to those of TP group.

Fatty acyl desaturase; Abalone; Real-Time quantitative PCR; Gene expression

2013-01-29;

2013-10-17

國家自然科學基金項目(編號: 39670573)資助

李明珠(1984—), 女, 山東煙臺人; 博士; 主要從事水產動物脂肪代謝研究。E-mail: limingzhuava@gmail.com; ava1022@163.com

麥康森, E-mail: kmai@ouc.edu.cn

Q-33; S966.1

A

1000-3207(2014)02-0328-07

10.7541/2014.47