E.tenella初次感染雛雞外周血T淋巴細胞亞群及增殖能力變化的動態研究

黃海斌，張許科，楊文濤，石少華，楊 軍，王 倩，趙 亮，王春鳳?，楊桂連?

（1.吉林農業大學動物科學技術學院吉林省動物微生態制劑工程研究中心，長春130118；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽471000）

雞球蟲病是由艾美爾球蟲引起的一種寄生蟲病，它可以造成雛雞大量死亡、飼料利用率下降、生長緩慢等后果，給養禽業帶來巨大的經濟損失，據統計全世界每年用于防治球蟲病的費用達30億美元［1］。在感染雞的7種球蟲中E.tenella的致病性最強，主要侵害雛雞盲腸及其附近區域。雖然雞感染球蟲后，可產生特異性的循環抗體和粘膜分泌抗體，但在艾美爾球蟲的保護性免疫中，體液免疫對球蟲的免疫保護作用較弱，而細胞介導的免疫在抗球蟲獲得性免疫中起主導作用［2］。成熟T細胞（CD3＋）分化的CD4和CD8亞群在抗球蟲的細胞免疫中具有重要作用，CD4細胞可以促進B細胞的成熟和分化，誘導CD8 T細胞活化，使之成為特異性CTL細胞。CD4細胞活化后可以分泌IFN－γ、IL－2和趨化因子等細胞因子，發揮抗球蟲作用。CD8細胞是最主要的殺傷性T細胞，它可以通過釋放穿孔素、顆粒酶或 Fas／FasL凋亡途徑導致細胞死亡［3］。本實驗通過利用E.tenella初次感染雛雞，檢測外周血中T細胞亞群及其增殖能力的動態變化，旨在探討E.tenella初次感染雛雞過程中細胞免疫機制，為雞球蟲病的免疫防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 1日齡肉雞購買于雙陽肉雞場，飼養于火焰消毒的雞籠中，飲水器、飼槽等器具均嚴格蒸煮消毒，飼料和飲水中不含有抗球蟲藥物。

1.2 蟲株 E.tenella孢子化卵囊，由吉林農業大學獸醫寄生蟲實驗室提供。蟲卵經復壯、分離、純化、孢子化后置于2.5%重鉻酸鉀中，4℃保存備用。

1.3 主要試劑與儀器設備 鼠抗雞CD4－PE、鼠抗雞 CD3－FITC、鼠抗雞 CD8－PE（southernbiotech）等單克隆熒光抗體均購于艾美捷科技有限公司。FACS緩沖液、RPMI 1640細胞培養液、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、 磷 酸 鹽 緩 沖 液（Phosphate buffered saline，PBS），均購買于 BD Bioscience公司；淋巴細胞分離液購買于 GE Healthcare Bio Sciences公司。Accuri C6流式細胞儀購于美國BD公司；高速冷凍離心機購于德國Sigma公司。酶標儀購于Thermo公司。

1.4 動物分組與處理 1日齡雛雞40只，飼養至11日齡，隨機分成2組：攻蟲組、空白對照組。攻蟲組雛雞于11日齡接種5×104個柔嫩艾美爾球蟲孢子化卵囊，空白組接種相同劑量的PBS。分別于攻蟲后第2、7、12、16、20天每組隨機選取 6只雛雞，利用抗凝管每只雛雞采集1 mL血液，加等量PBS稀釋后備用。

1.5 雛雞血液淋巴細胞的分離 在10 mL離心管中先加入4 mL淋巴細胞分離液，將稀釋后的血液2 mL沿管壁緩慢加入離心管中，2000 r／min水平離心20 min。將淋巴細胞層液體吸至離心管中，加5 mL PBS，混勻，2000 r／min 離心 5 min，棄上清。用 RPMI 1640（雙抗＋10%FCS），洗滌 1～2次，2000 r／min離心5 min，棄上清。 再用1 mL PBS懸浮細胞沉淀，混勻，血球計數板計數。

1.6 流式細胞術檢測雛雞 CD4＋、CD8＋T 淋巴細胞將獲得淋巴細胞進行分管，分別設陰性對照管、CD4－PE、CD3－FITC 和 CD8－PE 單標管。 每個樣品分2管，每管取1×106個細胞，加1 mL FACS緩沖液，4 ℃ 2000 r／min 離心 5 min，棄上清，加 100 μL FACS緩沖液重懸細胞，每管加入10 μL對應的抗體，4℃避光孵育1 h。加1 mL FACS緩沖液洗滌細胞2次，4℃ 2000 r／min離心5 min，棄上清，沉淀用100 μL FACS緩沖液懸起，將細胞懸液過膜（70 μm），最后使用BD Accuri C6流式細胞儀上機檢測。CD3＋CD4＋T淋巴細胞設門方法如圖1所示，CD3＋CD8＋T淋巴細胞按相同方法設門。

圖1 CD3＋CD4＋T淋巴細胞設門方法

1.7 MTS比色法檢測雛雞血液淋巴細胞增殖 實驗設置空白對照組（加RPMI 1640完全培養液）、對照組（加淋巴細胞懸液）和實驗組，每組設3個重復孔。取5×105個淋巴細胞置于96孔板中補加RPMI 1640 完全培養液至 190 μL，再加入 10 μL PHA（終濃度為 10 ug／mL），42 ℃ 5%CO2培養48 h；然后加入 MTS，20 μL／孔；在 42 ℃ 5%CO2的環境下培養4 h。用酶標儀于490 nm波長檢測各孔吸光度（A）值，并計算刺激指數（SI）。

1.8 數據處理 利用 BD Accuri C6軟件、Graph?Prism5.0軟件和spss軟件進行數據分析與統計。

2 結 果

2.1 E.tenella 感染后雛雞外周血中 CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T淋巴細胞亞群動態變化 11日齡雛雞初次感染 E.tenella 后第 2、7、12、16、20 天外周血中CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T 淋巴細胞在 CD3＋T 淋巴細胞中所占比例如圖2所示。結果顯示，攻蟲組雛雞外周血中 CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T 淋巴細胞于感染后7～20 d明顯高于對照組雛雞（P＜0.05和P＜0.01），并且均于感染后第12 d達到峰值。

圖2 外周血中 CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T 淋巴細胞亞群動態變化

2.2 E.tenella 感染后雛雞外周血中 CD4＋／CD8＋比值的動態變化 為評價感染E.tenella后雛雞免疫狀態和免疫平衡的變化，本實驗檢測了外周血中CD4＋／CD8＋比值的動態變化。雛雞外周血中CD4＋、CD8＋T 淋巴細胞比例和 CD4＋／CD8＋比值的動態變化見表1。11日齡雛雞外周血中CD4＋／CD8＋比值在初次感染E.tenella后第7 d開始明顯升高，于 16 日齡達到 1.78，20 d 時下降到 1.61。

表1 外周血中CD4＋、CD8＋T淋巴細胞比例和CD4＋／CD8＋比值的動態變化

2.3 E.tenella感染后雛雞外周血淋巴細胞增殖能力的動態變化 11日齡雛雞初次感染E.tenella后20 d內，外周血淋巴細胞增殖反應于12～20 d明顯高于對照組雛雞（P＜0.05），并于感染后第 16 d達到峰值（圖3）。

圖3 外周血淋巴細胞增殖能力的動態變化

3 討 論

細胞免疫在抗球蟲免疫中發揮著重要作用，T細胞能識別不同的抗原而介導不同類型的細胞免疫效應。CD3是T細胞的成熟標志，它被認為是T細胞發揮免疫作用的信號，并且在抗原識別過程中，CD3起著信號傳導的作用［4］。外周血中CD3＋T細胞主要由CD4＋和CD8＋T淋巴細胞組成。之前的研究中大多采用免疫組化法檢測腸道局部淋巴細胞亞群的變化，感染局部與各器官的免疫細胞通過循環系統相關聯，通過檢測外周血中淋巴細胞亞群的變化可以更好的反映宿主的免疫狀態；并且應用FCM可以簡單、準確地檢測標記CD分子的T淋巴細胞亞群動態變化。

本實驗結果顯示從感染后第7天開始雛雞外周血中 CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T 淋巴細胞明顯高于對照組，但是感染后第2天兩個細胞亞群與對照組相比并沒有明顯升高。這可能與球蟲的生活史有關，E.tenella孢子化卵囊進入腸道后48 h主要發生了卵囊釋放子孢子、子孢子侵入上皮細胞、在細胞內繁殖形成裂殖體這三個過程。在侵入過程中子孢子釋放蛋白可以刺激免疫細胞產生免疫反應［5］，但是淋巴細胞的活化需要抗原遞呈等過程做前提，并且子孢子侵入細胞后在細胞內增殖，組織局部缺乏抗原的持續刺激，這些都能解釋為什么在感染后第2天雛雞外周血中T淋巴細胞并沒有明顯增多。

鄭明學等人通過ABC法檢測E.tenella感染后腸粘膜中T淋巴細胞的變化，發現腸粘膜中CD4＋、CD8＋T淋巴細胞分別于感染后第6天、第8天達到峰值［6］。 Rothwell的研究也顯示 E.maxima感染后3～5 d腸固有層中淋巴細胞達到峰值［7］。但是本實驗結果顯示在感染后第12 d外周血中CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T 淋巴細胞達到最高值，這可能與淋巴細胞的歸巢效應有關。抗原一進入機體就被吞噬細胞吞噬并運往外周淋巴結、脾臟或粘膜相關淋巴組織，在哪里被抗原遞呈細胞（APC）消化處理成抗原多肽并與細胞內的MHCⅡ類分子結合形成Ag－MHC復合物，再經遞呈、活化，成為效應細胞。一部分效應T細胞留在淋巴組織，輔助B細胞產生抗體；另一部分被活化的CD4＋T細胞進入循環系統，歸巢到抗原持續存在的盲腸周圍，使其發揮消除病原的作用［8］；研究發現抗原特異性CTL主要集中在受感染的盲腸組織內，外周血中相對較少［9］。

在感染過程中機體良好的免疫功能要保持適度的反應水平和維持動態平衡，CD4＋／CD8＋比值在臨床上作為免疫狀態的重要指標。正常情況下比值在1～2范圍內變化，其值下降、升高可以反映機體處于免疫抑制或免疫增強狀態［10］。本實驗發現雛雞初次感染 E.tenella 后外周血 CD4＋／CD8＋比值從第7天開始明顯升高，于第16天達到1.78，第20天時下降到1.61。結果提示，E.tenella初次感染能刺激免疫系統增強免疫反應，對雛雞抗再次感染將發揮重要作用。大量球蟲感染可使機體免疫處于抑制狀態［11］，在本實驗檢測的20天內并沒有觀察到明顯的免疫抑制反應，這可能與檢測部位、攻毒劑量、寄生蟲毒力有關。現已證明多種原蟲的感染能夠增強機體的抗病毒、抗腫瘤免疫反應［12］，重組的E.tenella抗原也可以增強CD8＋T淋巴細胞的CTL 作用［13］。

本實驗結果顯示雛雞初次感染E.tenella后外周血T淋巴細胞增殖反應于感染后第12～20天明顯高于對照組雛雞，并于感染后第16天達到峰值，提示T淋巴細胞在抗球蟲免疫中具有重要作用。CD4＋T淋巴細胞可以通過分泌細胞因子（IFN－γ、IL－2、TNF 等）、誘導 CD8＋T 細胞活化，發揮免疫調節作用［14］。CD8＋T被抗原刺激后分化成CTL細胞發揮殺傷作用，CTL細胞主要生物學功能是消除宿主細胞內感染和溶解細胞內原蟲［15］。一部分活化的CD4＋、CD8＋T細胞成為記憶性T淋巴細胞，這些細胞可以通過循環系統到達外周免疫器官，在球蟲再次感染時迅速增殖并發揮抗球蟲作用。

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