HPLC－PDA法測定獸藥中非法添加四種解熱鎮痛抗炎類藥物

李慧素，杜紅鴿，吳寧鵬，臧和英，付盼盼

（1.河南省獸藥監察所，鄭州450008；2.河南出入境檢驗檢疫局，鄭州450003）

解熱鎮痛抗炎類藥物包括非甾體類抗炎藥（如對乙酰氨基酚、安乃近等）和甾體類糖皮質激素類抗炎藥（如地塞米松、地塞米松磷酸鈉等），具有良好的退熱、鎮痛、抗炎、抗風濕等作用。目前，一些不法企業受經濟利益的驅使，通過非法添加解熱鎮痛抗炎類藥物使其獸藥具有了速效、高效、特效的優點，從而取得高額利潤。由于非法添加行為是隱形的，增強藥效的同時帶來了藥量疊加的中毒風險和藥物殘留隱患，通過食物鏈傳遞，給人體健康造成嚴重危害［1－3］。為了打擊非法添加的違規行為，迫切需要建立獸藥制劑中非法添加解熱鎮痛抗炎類藥物的檢測方法。

目前，對非法添加的對乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林和地塞米松磷酸鈉進行了一種或幾種藥物的測定［4～6］，但還未對板藍根注射液、穿心蓮注射液及氟苯尼考粉、替米考星預混劑等制劑進行監測。本文利用二極管陣列檢測器，建立了高效液相色譜檢查方法，可以有效監測非處方成分的干擾，提高了對非法添加藥物的定性和定量測定［7］。

1 材 料

1.1 儀器與試劑 Waters HPLC高效液相色譜系統，包括二極管陣列檢測器、Empower2色譜工作站；MILIPORE超純水器；METTLER XP205電子天平。甲醇為色譜純，其他均為分析純，水符合實驗室一級水要求。

1.2 藥品 安乃近對照品（批號為H0291105，含量為100.0%）和地塞米松磷酸鈉對照品（批號為H0240805，含量為94.7%），均來自中國獸醫藥品監察所；對乙酰氨基酚對照品（批號為100018－200408，含量為100.0%）和地塞米松對照品（批號為100129－200303，含量為100.0%），均來自中國藥品生物制品檢定所。安乃近、對乙酰氨基酚原料藥均來自河南某獸藥生產企業。

氟苯尼考粉，氟苯尼考預混劑，替米考星預混劑，磷酸泰樂菌素預混劑，穿心蓮注射液，板藍根注射液，替米考星注射液均來自市售樣品，經檢測均不含對乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters X－Bridge C18（150×4.6 mm，5 μm）；柱溫 30 ℃；進樣量 10 μL。 流速0.8 mL／min；二極管陣列檢測器，采集波長為 200～400 nm光譜圖和240 nm波長處的色譜圖。流動相A：磷酸二氫鈉 3.0 g加水至 1000 mL，加三乙胺1 mL，用氫氧化鈉調 pH 值至 7.0±0.2。 流動相 B：甲醇。按表1進行梯度洗脫。該色譜條件下，四種對照品出峰時間順序依次是對乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松磷酸鈉和地塞米松，相鄰色譜峰之間的分離度均符合要求，且色譜峰尖銳對稱。結果見圖1。

表1 梯度淋洗表

圖1 4種解熱鎮痛藥物的色譜圖及光譜圖

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液 （臨用前配制）精密稱取對乙酰氨基酚、安乃近，地塞米松和地塞米松磷酸鈉對照品各50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對照品貯備液；再分別精密量取2.0 mL于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 陰性空白溶液 取無非法添加的各制劑1.0 g或1.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇適量溶解（粉散劑需要超聲10 min，并放冷至室溫）。用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取2.0 mL，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為陰性空白溶液。

2.2.3 空白添加溶液 取無非法添加的各制劑，乙酰氨基酚和安乃近分別按1%、2%、5%添加，地塞米松和地塞米松磷酸鈉按 0.15%、0.2%、0.5%添加，照2.2.2項下操作制備成各制劑的陰性對照溶液。

2.2.4 建立光譜數據庫的溶液 以乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉對照品溶液（40 μg／mL）作為建立光譜數據庫的溶液。

2.3 峰純度檢查 對供試品溶液色譜圖中四種解熱鎮痛類藥物色譜峰進行峰純度檢查，結果見圖2和表2。結果顯示，各陰性空白在240 nm處均無紫外吸收，對目標分析物無干擾，四種解熱鎮痛類藥物能達到很好的分離，且各色譜峰的純度角度均小于純度閾值，表明此色譜條件下，四種解熱鎮痛藥物的出峰位置無其他干擾峰，為單一物質峰，方法可行。

圖2 供試品（酒石酸泰樂菌素預混劑）添加解熱鎮痛類藥物純度圖

表2 峰純度檢查結果表

2.4 光譜相似度檢查 對供試品溶液中對乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉的光譜圖與光譜庫進行匹配，匹配角度均小于匹配閾值（表2）。結果表明，供試品溶液中相應色譜峰的光譜與對乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉光譜庫的光譜非常相似，可認為是同一物質。

2.5 方法學考察

2.5.1 溶液穩定性 取混合對照品溶液（50 μg／mL），室溫放置于 0、3、6、9、12、14 h 分別進樣測定，四種解熱鎮痛藥物色譜峰面積RSD均小于0.7%，表明該溶液在14 h內穩定。

2.5.2 線性關系 精密量取4種解熱鎮痛類藥物的對照溶液適量，用80%甲醇稀釋成5、10、20、50、100 μg／mL的系列混合標準溶液，從低濃度到高濃度依次注入高效液相色譜測定。以標準溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，求得線性回歸方程及相關系數（表3和圖3）。結果表明，4種解熱鎮痛類藥物的濃度在5～100 μg／mL范圍內呈良好的線性關系。

表3 4種解熱鎮痛類藥物的線性方程和相關系數

圖3 4種解熱鎮痛類藥物標準曲線圖

2.5.3 回收率試驗 由于添加回收試驗4種解熱鎮痛類藥物使用量較大，考慮用純度符合要求的獸藥原料藥代替對照品進行添加回收試驗，即在空白試樣中分別添加對乙酰氨基酚和安乃近原料藥，而地塞米松磷酸鈉和地塞米松由于原料價格昂貴，沒有搜集到原料，因此用對照品溶液進行添加回收試驗。

精密稱取對乙酰氨基酚和安乃近原料各10、20、50 mg，各置 50 mL量瓶中，加陰性空白 1.0 g或1.0 mL，加甲醇適量，超聲 10 min，放冷，甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL置50 mL量瓶中，加地塞米松和地塞米松磷酸鈉對照品貯備液各0.6、0.8、1.0 mL，混勻，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，每個濃度制備三份平行樣品。計算回收率及批內變異系數。結果顯示，對乙酰氨基酚平均回收率為84.2%～119.2%，安乃近平均回收率為 73.5% ～118.6%，地塞米松磷酸鈉平均回收率為82.5%～115.1%，地塞米松平均回收率為87.9%～115.7%，批內變異系數為0.1%～5.8%，結果見表4～表10 所示。

表4 穿心蓮注射液中添加4種解熱鎮痛類藥物回收率試驗結果

表5 板藍根注射液中添加4種解熱鎮痛類藥物回收率試驗結果

表6 氟苯尼考預混劑中添加4種解熱鎮痛類藥物回收率試驗結果

表7 氟苯尼考粉中添加4種解熱鎮痛類藥物回收率試驗結果

表8 替米考星預混劑中添加4種解熱鎮痛類藥物回收率試驗結果

表9 磷酸泰樂菌素預混劑中添加4種解熱鎮痛類藥物回收率試驗結果

表10 替米考星注射液中添加4種解熱鎮痛類藥物回收率試驗結果

2.5.4 檢測限 取混合對照品溶液適量（建議取1 mL或2 mL）置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，梯度稀釋后添加到陰性對照溶液中，進行檢測，以光譜圖（圖4～圖7）失真的最大濃度作為方法的檢測限，安乃近和地塞米松磷酸鈉最低檢出濃度 均 為 2 μg／mL， 在 各 制 劑 中 的 檢 測 限 為3.0 mg／mL（mg／g），對乙酰氨基酚和地塞米松最低檢出濃度均為1 μg／mL，在各制劑中的檢測限為1.5 mg／mL（mg／g）。

2.5.5 精密度 取混合對照品溶液（50 μg／mL），重復進樣6次，測定峰面積。結果表明：四種成分的保留時間 RSD小于 0.1%，峰面積 RSD小于1.0%，結果符合精密度的要求。

2.5.6 耐用性 從柱溫、流動相pH值、色譜柱三個方面考察方法的耐用性。分別改變柱溫為25、30、35 ℃，流動相 A 的 pH 值 6.8、7.0、7.2，色譜峰出峰順序無變化，保留時間稍有變化；使用不同品牌、不同型號的色譜柱，如 Thermo Hypersil Gold（4.6×250 mm，5 μm）；Waters XBridge C18（4.6×150 mm，5 μm）；Waters XBridge C18（3.5×150 mm，5 μm）等，結果四種成分仍能很好地分離且保留時間合理。在最佳實驗條件的選擇中流速的變化對四種成分的影響也不大，本方法的耐用性較好。

2.5.7 專屬性 在滿足系統適用性的條件下，4種解熱鎮痛類藥物能夠很好地分離，板藍根和穿心蓮注射液無紫外吸收，氟苯尼考、泰樂菌素和替米考星制劑中主成分和雜質均不干擾解熱鎮痛類藥物的檢測（圖8～圖14）。

圖4 安乃近和地塞米松磷酸鈉的檢測限光譜圖（3 mg／mL）

圖5 安乃近和地塞米松磷酸鈉的檢測限色譜圖（3 mg／mL）

圖6 對乙酰氨基酚和地塞米松的檢測限光譜圖（1.5 mg／mL）

圖7 對乙酰氨基酚和地塞米松的檢測限色譜圖（1.5 mg／mL）

圖8 板藍根注射液空白及空白添加色譜圖

圖9 穿心蓮注射液空白及空白添加色譜圖

圖10 氟苯尼考預混劑空白及空白添加色譜圖

圖11 氟苯尼考粉空白及空白添加色譜圖

圖12 酒石酸泰樂菌素預混劑空白及空白添加色譜圖

圖13 替米考星注射液空白及空白添加色譜圖

圖14 替米考星預混劑空白及空白添加色譜圖

3 討論與小結

3.1 稀釋溶劑的選擇 本方法先后選擇了甲醇［8］、80%甲醇、50%甲醇對標準貯備液進行稀釋，經測定發現，50%的甲醇為溶劑時，安乃近降解比較快，產生另外一種物質；甲醇和80%甲醇溶液為溶劑時，安乃近基本未發生降解。同時文獻［9］也證實，安乃近在水溶液、體內及加熱的條件下極不穩定，主要產生MAA（4－甲氨基安替比林）的降解產物。而甲醇為溶劑時，個別色譜柱會出現峰型不對稱的現象。因此，試驗選擇了80%的甲醇作為稀釋溶劑，并建議樣品溶液在14 h內完成測定。

3.2 流動相洗脫方式的選擇 由于地塞米松和對乙酰氨基酚、安乃近極性差別較大，采用等度洗脫時，對乙酰氨基酚很快出峰，地塞米松很晚出峰甚至無法洗脫出來，當采用梯度洗脫［5］時，可以使4種解熱鎮痛類藥物很好的分離，分離度均大于3.0，峰型對稱。因此，選擇梯度洗脫的方式進行測定，并且該梯度條件亦可適用于超高效液相色譜測定。

3.3 添加回收濃度選擇與結果分析 由于四種藥物藥效濃度不同，在獸藥制劑中的添加量也不同。由于摻假過程復雜，實際添加比例是未知的，為模擬獸藥制劑的非法添加情況，本研究在做添加回收試驗時，以各藥物在制劑規格的1%、2%、5%作為三個添加濃度。

試驗過程中，由于安乃近容易降解產生MAA，隨著樣品溶液放置時間的延長，容易造成安乃近的回收率偏低；而地塞米松和地塞米松磷酸鈉采用標準溶液添加，定量添加的標準溶液體積是造成低濃度添加回收結果偏低的主要原因。

本方法采用二極管陣列檢測器進行測定，實現可以檢測6種制劑的主成分是否干擾對乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉，同時可以通過峰純度檢查確保添加藥物出峰處無干擾，再經光譜相似度檢查鎖定非法添加藥物，同時通過保留時間與對照品進行比對相佐證，實現獸藥中非法添加物的高效、快速、準確識別。通過方法學考察，本方法可以用于獸藥中對乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉的檢測。

［1］楊秀玉，萬仁玲，馬玉葉，等.高效液相色譜法定性檢測5種中獸藥散劑中違規添加的氯霉素［J］.中國獸藥雜志，2006，40（12）： 11－14.

［2］李 銳.中成藥、保健食品中非法添加化學成分的檢測［J］.中國藥業，2007， 16（18）：10－11.

［3］周 媛，貢玉清，邵德佳.有關中獸藥中非法添加化學藥物的探討［J］.中獸醫醫藥雜志， 2010， 29（4）： 28－31.

［4］農業部1848號公告－黃芪多糖注射液中非法添加解熱鎮痛類、抗病毒類、抗生素類、氟喹諾酮類等11種化學藥物（物質）檢查方法［S］.

［5］農業部2508號公告－1－注射用青霉素鉀（鈉）中非法添加解熱鎮痛藥物檢查方法［S］.

［6］農業部1956公告.乳酸環丙沙星注射液中非法添加對乙酰氨基酚檢查方法［S］.

［7］劉 寶，周莉莉，王 駿，等.基于二極管陣列檢測器的色譜峰純度的快速直觀鑒定［J］.光譜實驗室， 2011， 28（4）： 1684－1689.

［8］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（2010年版）一部［S］.

［9］郝利華，于曉輝，董玲玲，等.HPLC－PDA法同時測定黃芪多糖注射液中非法添加的四種解熱鎮痛類藥物［J］.中國獸藥雜志，2014， 46（8）： 28－31.