鴨腸炎病毒囊膜糖蛋白gE基因序列分析及真核表達載體的構建

文晶亮，李啟紅，李俊平，劉 丹，李 嶺，楊承槐，李慧姣，夏業才

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

gE蛋白是皰疹病毒家族中較為重要的糖蛋白之一，由位于US區的US8基因編碼。據報道皰疹病毒gE基因是皰疹病毒從視網膜、嗅覺上皮細胞、三叉神經節侵入中樞神經組織所必須的毒力基因，對皰疹病毒在體內毒力表達、侵襲神經核沿著神經傳遞起著決定性的作用，另外還能促進病毒在細胞之間擴散［1－4］。 目前對人皰疹病毒、偽狂犬病毒、牛皰疹病毒等皰疹病毒糖蛋白gE基因及其編碼蛋白已有大量研究［5－7］，而對鴨瘟病毒 gE基因及其編碼蛋白尚未有深入的報道。因此，本研究PCR擴增了DEV的gE基因完整開放閱讀框（gE）和去信號肽的gE基因（gE’），分別克隆至真核表達載體pCDNA3.1，轉染 vero細胞，并應用 RT－PCR 和間接免疫熒光檢測gE、gE’蛋白在vero細胞中的轉錄、表達，旨在探討gE蛋白在真核細胞中的表達，為gE蛋白的功能研究、鴨瘟抗體檢測奠定基礎，為深入了解鴨瘟病毒感染的發病機理提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞 鴨腸炎病毒AV1221株，由中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心提供；vero細胞，由本實驗室保存；E.coli DH5α感受態細胞，購于天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 真核表達載體 pCDNA3.1，由本實驗室保存；pMD18－T載體、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、EcoRⅠ、XhoⅠ、MarkerⅣ、T4 DNA 連接酶，均購自大連寶生物工程有限公司；Lipofectamine 2000，購自 Invitrogen 公司；OPTI－MEM?I培養液，購自gibco?公司；FITC標記的兔抗雞熒光二抗，購自美國sigma－aldrich公司；DMEM高糖細胞培養液、TBD標準胎牛血清購于賽墨飛世爾生物化學制品有限公司。

1.1.3 試劑盒 高純度質粒小提中量試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于天根生化科技有限公司。

1.1.4 血清 雞抗DEV陽性血清，由本實驗室制備；TBD標準胎牛血清，購于賽墨飛世爾生物化學制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據已發表的基因組序列，設計擴增鴨腸炎病毒AV1221株的gE基因完整ORF序列（gE）和去信號肽的gE基因（gE’）引物，由invitrogen公司合成。

針對gE的引物：

P1： 5’ －AAGAATTC ATGATGGTTACTTTTAT－3’，下劃線部分為酶切位點EcoR I；

P2：5’－AACTCGAGTCAGATGCGGAAACTAGA－3’，下劃線部分為酶切位點Xho I；

針對gE’的引物：

P11： 5’－AAGAATTCGACTATCATCAAGTGATT－3’，下劃線部分為酶切位點EcoR I；

P22： 5’－AACTCGAGTCAGATGCGGAAACTAGA－3’，下劃線部分為酶切位點Xho I；

1.2.2 DNA 模板提取 按參考文獻［8］進行。

1.2.3 gE基因的克隆 PCR反應體系：病毒DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，上游引物 P11 μL，下游引物 P21 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.125 μL，ddH2O 16.375 μL，總體積 25 μL。

反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性40 s，46.2 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸 1 min 30 s，30 個循環后，72℃延伸10 min。反應結束后，取3 μL PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 去信號肽 gE 基因（gE’）序列的克隆 PCR

反應體系：病毒 DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，上游引物P111 μL，下游引物 P221 μL，10 ×Ex Taq buffer 2.5 μL，Ex Taq DNA 聚 合 酶 0.125 μL， ddH2O 16.375 μL，總體積 25 μL。

反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性40 s，47℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，30個循環后，72℃延伸10 min。 反應結束后，取3 μL PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 gE基因測序及序列分析 PCR產物用膠回收試劑盒回收后，分別連接到pMD18－T載體，轉化DH5α，獲得重組質粒 pMD18T－gE、pMD18T－ gE’。將酶切及PCR鑒定正確的重組質粒pMD18T－gE、pMD18T－gE’送Invitrogen公司測序，并用生物信息學軟件對測序正確的gE基因進行分析，預測gE基因編碼蛋白的功能。

1.2.6 真核表達載體的構建 gE基因測序正確后，用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別雙酶切克隆質粒 pMD18－gE、pMD18－gE’和載體 pCDNA3.1。回收、純化雙酶切gE、gE’基因和pCDNA3.1線性質粒，并用T4 DNA連接酶使雙酶切gE、gE’基因分別與 pCDNA3.1線性質粒連接，轉化 E.coli DH5α 感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’，進行酶切及 PCR 鑒定。

1.2.7 重組表達質粒轉染vero細胞 在轉染前20 h，消化vero細胞，轉入6孔細胞板，每孔6×105個細胞，待細胞鋪板密度在75%時進行轉染。

Lipofectamine 2000／DNA復合物的制備：分別將 0.8 μg pCDNA3.1－ gE、pCDNA3.1－ gE’質粒分別稀釋于不含血清和抗生素的opti－DMEM中，使混合液的終體積均為 50 μL，室溫孵育 5 min；2 μL Lipofectamine 2000分別稀釋于不含血清和抗生素的opti－DMEM中，使混合液的終體積均為50 μL，輕輕混勻，室溫孵育5 min；將50 μL Lipofectamine 2000稀釋液分別滴加到50 μL質粒稀釋液中，邊加邊混勻；室溫孵育20 min。

轉染 vero細胞：分別將 100 μL Lipofectamine 2000／DNA復合物加入到6孔板中，輕輕搖動使其均勻混合，置37℃培養4 h，棄去上清，加入10%胎牛血清的M199培養基，置37℃培養24 h后，用1%胎牛血清的M199培養基換液，置37℃培養24 h。

1.2.8 mRNA檢測 參照試劑盒操作說明，提取轉染后的細胞總RNA，將RNA反轉錄成cDNA，參照Invitrogen M－MLV反轉錄酶的說明書操作：模板RNA 5 μL，反轉錄引物 1 μL，dNTP（10 mmol／L）1 μL，DEPC 水補加至 12 μL，100℃ 水浴 5 min，馬上冰淬滅 1 min；短暫離心后加入 5×buffer 4 μL，DTT（0.1mol／L）2 μL，RNA 酶抑制劑 1 μL，輕輕混勻后 50℃水浴5 min；加入 M－MLV反轉錄酶1 μL，50 ℃水浴 50 min；70 ℃水浴15 min，冰淬滅；加入1 μL RNaseH，馬上進行PCR反應。PCR反應參照 1.2.3 和 1.2.4。

1.2.9 表達產物的檢測 應用間接免疫熒光法檢測表達蛋白，方法如下：取出6孔細胞板，用pH為7.2的PBST溶液漂洗細胞1次，加入0.5 mL預冷的甲醇溶液，固定15 min；棄去甲醇溶液，室溫放置2～5 min自然晾干；用PBST洗1次；加入100倍稀釋的雞抗DEV陽性血清，37℃孵育1 h，棄去DEV陽性血清，每孔用含0.05%吐溫－20的PBST洗3次后，用PBST液洗2次；加500倍稀釋的兔抗雞熒光抗體，37℃溫箱中避光孵育1 h，每孔用含0.05%吐溫－20的PBST洗3次后，用PBST洗2次，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

2 結 果

2.1 gE基因的 PCR擴增 分別以 gE基因的P1／P2為引物、gE’基因的 P11／P22為引物，病毒 DNA為模板PCR擴增gE、gE’基因，擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1400 bp的DNA片段，與預期片段大小相符（圖1）。

圖1 gE和gE’基因的PCR擴增結果

2.2 gE及gE’基因的克隆及酶切鑒定 回收純化后的gE、gE’PCR產物與pMD18－T連接，分別構建克隆質粒 pMD18T－gE、pMD18T－gE’，酶切、PCR 結果說明所克隆序列與目的片段大小相近（圖2、圖 3）。

圖2 重組質粒pMD18T－gE酶切及PCR鑒定結果

圖3 重組質粒pMD18T－gE’酶切及PCR鑒定結果

2.3 gE基因序列分析及編碼蛋白的功能預測

2.3.1 同源性分析結果 用NCBI網站的在線程序BLASTN對鴨瘟AV1221株gE基因序列與國內分離強毒 CHv 株 （GenBank：EU071044.1）、 國 內 疫 苗 株（GenBank：EU082088.2）和德國分離強毒 2085 株（GenBank：JF999965.1）基因序列進行比對，結果表明：鴨瘟AV1221株gE基因序列與國內分離強毒CHv株、國內疫苗株同源性均為100%，與德國分離強毒2085株同源性為99%，143位堿基變異（T－C），導致第48位氨基酸由蘇氨酸（T）變成了異亮氨酸（I），此外，412位（G－A）和1351位（C－T）堿基同義突變。

2.3.2 信號肽預測結果 用CBS網站的在線程序SignalP4.1對gE氨基酸序列進行信號肽預測，結果顯示：gE蛋白序列中預測到的C值、S值或Y值都大于臨界值，推測gE蛋白第1～22位氨基酸為信號肽（圖4）。

2.3.3 跨膜區的預測結果 本研究利用 TMHMM 2.0預測鴨瘟AV1221株gE蛋白的跨膜區，其結果顯示：gE蛋白在397～419位氨基酸有一個跨膜區，1～396位氨基酸位于胞膜外（胞外區），420～490位氨基酸位于胞膜內（胞質區）（圖5）。

圖4 gE氨基酸序列推倒肽鏈信號肽預測結果

圖5 gE氨基酸序列推倒肽鏈跨膜區預測結果

2.4 真核表達質粒的構建及鑒定 重組質粒pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’經 EcoRⅠ及 XhoⅠ雙酶切后分別得到約1400 bp和5400 bp的條帶，PCR鑒定結果也獲得了約1400 bp的條帶，說明成功構建了重組真核表達質粒 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’（圖 6）。

圖6 重組質粒 pcDNA3.1－gE、pcDNA3.1－gE’酶切及PCR鑒定結果

2.5 PCR 鑒定轉染結果 提取 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’轉染后的 vero 細胞總 RNA，并以提取的細胞總RNA為模板，分別以gE基因的P1／P2、gE’基因的 P11／P22為引物進行 RT－PCR 擴增，得到了相應大小DNA片段（圖7），而以提取的空載體pCDNA3.1轉染的 vero細胞總 RNA為模板RT－PCR擴增后則未見相應條帶，從轉錄水平上說明gE和gE’基因均在vero細胞獲得表達。

圖7 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’和 pCDNA3.1轉染vero細胞RT－PCR結果

2.6 表達產物的免疫熒光鑒定 轉染48h后，經用熒光顯微鏡觀察，只有重組質粒pCDNA3.1－gE’轉染的 vero細胞可見綠色熒光（圖 8 A），而pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1 轉染的 vero 細胞中未見明顯熒光（圖8B，C），結果表明gE’基因在vero細胞中獲得了正確表達，具有免疫原性，能與抗體結合。

圖8 真核表達載體轉染vero細胞后間接免疫熒光檢測結果

3 討論與小結

本研究結果表明，鴨腸炎病毒AV1221株 gE基因完整的開放閱讀框長為1473 bp，共編碼490個氨基酸，其中第1～22位氨基酸為信號肽序列。其基因序列與國內分離強毒CHv株［9］、國內疫苗株［10］和德國分離強毒 2085 株［11］均具有較高同源性，說明鴨腸炎病毒AV1221株gE比較保守。而軟件TMHMM 2.0預測表明gE蛋白是典型的囊膜糖蛋白，包括較長的胞外區（396個氨基酸）、跨膜區（23個氨基酸）和胞質區（71個氨基酸），這與常華［12］結果一致。

皰疹病毒gE蛋白表達載體的構建及表達是其功能研究的重要方面，Zhu等［13］將VZV gE構建在真核表達質粒pSVK3上，轉染COS－7細胞，用間接免疫熒光方法檢測到VZV gE蛋白在COS－7細胞中表達并定位于COS－7細胞的高爾基體。常華［12］利用間接免疫熒光方法檢測到DEV gE蛋白可在感染鴨胚成纖維細胞的胞漿中表達。在本研究中，含信號肽的表達載體pCDNA3.1－gE在vero細胞內完成了轉錄過程，但卻未能在vero細胞內檢測到熒光，與上述研究結果并不一致，推測可能與所用毒株、宿主細胞不同以及存在信號肽有關。因此又構建了去信號肽的真核表達載體pCDNA3.1－gE’，轉染vero細胞后完成了轉錄過程，并進行了表達，證實gE自身所具有的信號肽序列可以有效誘導gE蛋白分泌到細胞外，與軟件TMHMM 2.0預測結果一致。實驗表明，在真核表達體系中，信號肽的有無對gE蛋白的表達具有顯著的影響。

本研究通過酶切和PCR方法證實，成功構建了真核表達質粒 pCDNA3.1－gE 和 pCDNA3.1－gE’，并在轉錄水平和蛋白水平上檢測了pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’在 vero細胞中的表達，下一步將通過G418抗生素篩選穩定表達gE的vero細胞系，為gE蛋白的體外表達、功能研究、鴨瘟抗體檢測試劑盒的開發奠定了基礎。

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