妊娠期糖尿病胎鼠心臟發(fā)育過程中鋅指轉錄因子GATA結合蛋白4 的變化規(guī)律

黎旻

近幾年的流行病學調查結果顯示，妊娠期糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，且在妊娠期出現(xiàn)糖尿病會對胎兒的發(fā)育健康造成嚴重的影響，比較常見的為巨大兒、先天畸形甚至死胎[1]。有學者指出，妊娠期糖尿病可導致胎兒心臟畸形，從而嚴重影響胎兒的生長發(fā)育。研究顯示[2]，鋅指轉錄因子GATA結合蛋白4 同心臟發(fā)育之間存在明顯的相關性，為心臟發(fā)育過程中一個相對敏感的調控因子[3-4]。本研究對妊娠期糖尿病胎鼠心臟發(fā)育過程中鋅指轉錄因子GATA結合蛋白4 的變化規(guī)律進行分析探討，對妊娠期糖尿病SD鼠和妊娠非糖尿病鼠進行心臟GATA-4 mRNA水平檢測，并對比分析檢測結果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 研究裝研究對象為F級健康成年SD雌鼠50只、體質量(221±19)g，將其隨機分成對照組與觀察組，質量198～236 g，平均為（219±22）g，所有雌鼠均購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物許可證號為SCXK(粵)2008—0002，粵監(jiān)證字為2008 A 020。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 將以上兩組研究鼠進行人工受孕后，觀察組造模致妊娠糖尿病，并在受孕后12、15、19 d后行心臟解剖，對GATA-4 mRNA水平進行檢測，而后對比分析兩組檢測結果。

1.2.2 實驗方法 所需試劑包括有：濃度為2%的鏈脲佐菌素、GATA-4 抗體、Trizol提取液、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒、HRP標記的CAPDH、蛋白樣品試劑盒。首先將上述50只SD鼠進行人工受孕，觀察組經(jīng)腹腔注射濃度為2%的鏈脲佐菌素，造模致妊娠期糖尿病，而對照組則給予腹腔注射相同劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液[5-7]。給藥后3 d內對兩組研究鼠實施監(jiān)測血糖，并在受孕后的12、15 d 以及19 d后解剖取胎鼠心臟組織，經(jīng)HE染色后對心臟發(fā)育情況進行觀察，并作對比。

取新鮮的胎鼠心臟組織，給予500 μlRIPA裂解液后，在勻漿器上進行反復碾碎，并經(jīng)離心處理提取總蛋白，依照試劑盒說明書對總蛋白展開初步定量，而后取含有蛋白的10 μl溶液上樣，加入樣品處理液后，煮沸，經(jīng)SDS-PAGE電泳，持續(xù)時間為2 h，而后轉移至PVDF膜，在室溫下經(jīng)濃度為5%的脫脂奶粉進行1 h的封閉，洗膜后加Ⅰ抗后在4℃條件下孵育過夜，經(jīng)TBST洗膜3 次，而后加入Ⅱ抗，室溫下孵育1 h后經(jīng)TBST洗膜3 次，將化學熒光發(fā)光底物涂抹在膜表面，持續(xù)5 min后將膜表面的殘夜去除，放置在曝光盒中進行曝光、顯影以及定影[8]。對所得相關資料數(shù)據(jù)進行處理，并展開統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 觀察組與對照組胎鼠心臟畸形發(fā)生率比較 在受孕后19 d解剖的10 只鼠中，觀察組中發(fā)生胎鼠心臟畸形者4 只（40.0%），對照組發(fā)生胎鼠心臟畸形者1 例（10.0%），觀察組畸形發(fā)生率較對照組高（P<0.05）。

2.2 觀察組與對照組GATA-4 mRNA水平比較 在受孕后15 d后胎鼠心臟組織中GATA-4 mRNA水平最高，均高于12、19 d時檢測結果（P<0.05），且觀察組各時間段的檢測結果均較對照組發(fā)生明顯降低（P<0.05）。見表1。

表1 觀察組與對照組GATA-4 mRNA水平比較（±s）

表1 觀察組與對照組GATA-4 mRNA水平比較（±s）

注：與本組受孕后15 d比較，aP<0.05

組別 受孕12 d 受孕15 d 受孕19 d對照組 1.16±0.03 a 1.55±0.12 0.91±0.02 a觀察組 0.82±0.01 1.21±0.08 0.70±0.03 t值 13.2212 13.9824 13.7624 P值 0.0187 0.0136 0.0158

3 討論

妊娠糖尿病是指在妊娠后首次出現(xiàn)或者發(fā)病的糖尿病，經(jīng)流行病學調查結果顯示，在糖尿病孕婦中有80%以上者屬于妊娠糖尿病。有研究證實，妊娠糖尿病會對母親健康以及胎兒的發(fā)育產(chǎn)生十分嚴重的影響，會造成胚胎期心血管畸形[9]。目前關于妊娠糖尿病的發(fā)病機制還不是十分清楚。有學者指出[10]，高血糖會利用諸多的生物化學機制的誘導而對人體造成損害，其中以高血糖誘發(fā)線粒體活性氧簇最為顯著，并且，妊娠糖尿病的發(fā)生還會受遺傳、免疫等因素的影響。

流行病學調查結果顯示[11]，妊娠期糖尿病會造成吸收胎、死胎、畸形胎、巨大兒等諸多的發(fā)育異常。在造成心臟畸形中，會導致心室流出道梗阻、室間隔缺損、室間隔裂、心腔擴大、肌壁肥厚等[12]。本研究中，在受孕后15 d后胎鼠心臟組織中GATA-4 mRNA水平最高，均高于12、19 d時檢測結果（P<0.05），且觀察組各時間段的檢測結果均較對照組發(fā)生明顯降低（P<0.05），可見，本研究在采用2%STZ腹腔注射已受孕的SD雌鼠成功建立GDM模型鼠基礎上，觀察組中吸收胎、死胎、畸心胎、巨大胎兒等發(fā)育異常例數(shù)較對照組明顯提升；且觀察組胎鼠心臟發(fā)育異常，即包括心室流出道梗阻、室間隔缺損及室間隔裂、肌壁肥厚、心腔擴大等發(fā)生率均較對照組明顯增加，這與相關文獻報道[13]的妊娠糖尿病確實會誘發(fā)心臟發(fā)育異常結果一致。

研究證實，GATA-4 參與了整個心臟發(fā)育過程中，為十分重要的一種轉錄因子，使心臟正常發(fā)育所必需的一種物質，會對諸多的心臟轉錄基因表達進行有效的調控，同時會利用鋅指結果同其它的心臟轉錄因子發(fā)生相互作用。GATA-4 主要[14]在胚胎期的心臟、肝臟、性腺以及內胚層表達，同其他的因子發(fā)生協(xié)同作用，對心原細胞的特異性分化等進行控制，目前關于GATA-4對妊娠糖尿病胎鼠心臟發(fā)育的影響還不是十分清楚，曾有相關文獻指出其為導致胎鼠心臟發(fā)育異常的主要因素[15]。本研究對50 只人工受精的雌鼠進行GATA-4 mRNA水平監(jiān)測，結果發(fā)現(xiàn)，妊娠糖尿病的觀察組中胎鼠心臟畸形的發(fā)生率較對照組高，且GATA-4 mRNA水平較對照組發(fā)生明顯的降低，由此可知，GATA-4 mRNA水平低表達會對胎鼠心臟發(fā)育產(chǎn)生一定程度的影響。

曾有學者經(jīng)實驗證實[15]，在高血糖的環(huán)境下，大鼠的心肌細胞中GATA-4 蛋白含量會發(fā)生明顯降低，并且經(jīng)STZ所誘導的糖尿病模型鼠心臟組織中GATA-4 水平也明顯降低，GATA-4過度表達也可以對高血糖所引起的心肌細胞死亡等作用進行抑制，由此可以證實GATA-4 蛋白降解的增加為誘發(fā)高血糖致心臟畸形的一個主要因素。

綜上所述，作為多種心臟基因表達的調控因子，GATA-4 為妊娠糖尿病致心臟發(fā)育異常的一個重要機制，這一結果對于今后的妊娠糖尿病胎兒發(fā)育研究具有重要的臨床意義。

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