操作簡單且低成本的木聚糖酶檢測方法

邵建忠 潘雪男 夏俊花

在所有單胃動物飼料中，約85 %的飼料被認為至少添加了一種商用酶制劑，飼料配方的成功越來越依賴于這些酶制劑所帶來的動物生產性能上的益處。木聚糖酶分析方法上的突破能夠確認酶在飼料中的存在及其水平。

中圖分類號：S816.17 文獻標識碼：C 文章編號：1001-0769（2014）06-0012-02

對飼料生產商而言，能夠證明飼料成品含有能確保其含有的酶達到正確的含量和活性的標準是飼料質量控制和保證方案的一個重要組成部分。例如，如果日糧在添加木聚糖酶后，其能量水平可以降低，飼料中酶的含量和活性能達到如預計的水平是非常重要的。由于在實現這一目標的過程中出現任何失誤，將很可能會導致動物生產性能的顯著下降，并隨后會導致經濟損失，因此需要有一個能夠確認成品飼料中酶的存在及其含量的正式且精確的分析方法。

1 酶含量的檢測

然而，盡管每年用于釋放飼料原料中養分或降低抗營養作用的飼用酶費用超過7億萬美元，但檢測成品日糧中酶的實驗室檢測方法到今仍因昂貴的成本且費時而其應用受到限制。不僅如此，雖然目前有公認的植酸酶的通用質量控制方法，而木聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶或淀粉酶卻沒有類似的方法。

在大多數情況下，檢測方法的開發主要是為了滿足某些監管部門的需求，如歐盟的相關部門，而對飼料行業的需求不太重視，后者需要可靠、精確且操作方便、具有成本效益的檢測方法。該結果是出現了許多生產商和某些產品專用的分析方法，這些方法通常難以獨立運用且成本高，這對需要能夠快速、簡便、精確和低成本檢測方法的飼料生產商或終端用戶來說幾乎不實用。

另外，目前實驗室使用的分析方法往往對實驗條件，如pH值、溫度和所用反應物的組成成分，微小的變化非常敏感。結果是不同實驗室測得的酶活性很可能差異巨大，導致飼料生產商在需要進行質量保證檢測時，每次除了將樣本送回酶供應商外幾乎難以做出其他選擇。

2 檢測方法的局限性

這種情況很不理想，是AB Vista公司開發一種可以提高飼用酶檢測標準（通過克服這些基本問題同時避免目前限制現有檢測方法的許多不足）的檢測手段的驅動力。例如，先前的方法通常依賴于酶在某些固定條件，如pH、溫度、時間和底物濃度下與特定底物相互的作用，隨后對最終釋放出的終產物進行定量。

換言之，此類方法僅能在一組特定的預定條件下檢測酶的活性，因此幾乎不可能鑒別飼料原料中添加酶和內源性酶所產生的活性，即使這些內源性酶在動物體內效應有限，但是添加酶以受飼料中抑制因子的影響而限制了其作用。

同樣受到關注的是以下事實，即盡管這一方法需要配制相當先進的實驗室設備和大約一天的時間方能完成，但其仍不能鑒別不同來源的同類型的酶。在商業性條件下，酶在動物體內的效應相差很大，具體取決于其特性，而酶的特性因來源和開發條件的不同而各異。可以用絕對正確的方法鑒定某種特定酶的能力是非常重要的。

本文還應指出，非基于實驗室的分析方法能夠正確地預測酶在動物體內的作用。在試管中復制目標動物精確的胃腸道環境簡直是不可能的，試管存在能夠限制出于基本質量控制目的的任何體外分析方法的局限性。

3 ELISA方法的開發

出于這些原因，AB Vista公司與英國的酶服務與咨詢公司（Enzyme Services and Consultancy）的研究人員合作，采用了一種極為不同的方法，以便為能夠直接測定飼料中酶及其活性的飼用酶分析方法建立一種新的標準。由此獲得的酶聯免疫吸附法（ELISA）是基于通過利用一種具有很強針對性及高度準確性的特定抗體—即特定飼用酶的活性形式，捕捉并固定目標蛋白的原理（圖1）。

利用為特定飼用酶開發的每一種ELISA方法，該抗體專為匹配位于或靠近完整活性位點上該蛋白質的一部分設計的。這可避免誤檢飼料加工中甚至部分已變性的任何酶，并能確保不受內源性酶和不同來源的其他添加酶的影響。這本身是飼用酶檢測精度上的一個巨大的進步。

隨后，捕獲的蛋白質（即目標酶）可利用二次反應法（—可產生一種能與規定標準進行比較以確定酶水平的顏色），對酶的存在及含量進行定量。這是一種快速、低成本、高精確的方法，能夠在世界各地的任何地方進行，有較高的重復性，對實驗和環境條件改變的敏感性低于早先的方法。

每一種ELIAS方法還可用于僅對酶進行快速的檢測，或對酶含量進行實際的定量，檢測時無需配備任何復雜的設備或專業的檢測人員。

4 獨特的優點

這是一種獨特的方法，且這種新的檢測標準已被證明非常成功，因為AB Vista公司早先推出的Quantum植酸酶 ELISA分析法現在加入了Econase XT木聚糖酶的新ELISA方法。對這二種酶，二種類型的ELISA檢測試驗盒已經完成開發，第一個是QuickStix橫向流快速檢測試劑盒，可在5 min內對活性酶的商業水平進行定量測定。

QuickStix檢測試劑盒能夠檢測小到單個飼料顆粒中的酶含量，成為飼料生產商出色的質量控制工具，同時它還能證明在通過胃腸道時酶活性的保留情況。每個QuickStix上的二個紅色指標標記能夠與飼料樣本的提取物發生反應，上一條紅線可證實QuickStix正發揮著恰當的功能，而下一紅線的顏色強度與Econase XT木聚糖酶活性水平呈正比例。

第二個試劑盒是QuantiPlate微滴度試劑盒，能對商用飼料中正常含量內的酶活性進行正確的定量（圖1）。在3 h內能夠獲得正確的檢測結果，它被設計成操作簡便且易懂。

5 檢測結果確認

為確認該結果的精確性和重復性，研究人員添加0 U/kg （圖1中樣本1）～48 000 U/kg（圖2中樣本8） Econase XT木聚糖酶的一系列飼料用ELISA QuantiPlate方法和標準濕化學分析法進行分析。結果顯示QuantiPlate檢測結果與根據添加量預測的飼料中酶含量間極為一致（R2>0.99，P<0.001），證實了這一新的檢測方法的穩定性和價值（圖2）。濕化學法獲得的較高結果是由于其還檢測出了大約3 000 U/kg的內源性酶活性，而新的QuantiPlate分析法則忽略了這一活性。

很顯然，Econase XT 的QuantiPlate和QuickStix檢測法在建立新的、高標準的經濟合算且操作方便的木聚糖酶檢測方法上起著重要的作用。對那些正在尋找有效質量控制和有保障的程序且盡可能降低對昂貴且費時的實驗室檢測方法的飼料生產商而言，毫無疑問向前邁出了非常實質性的一步。□□

原題名：Cost-effective and convenient xylanase enzyme analysis（英文）

原作者：Hadden Graham博士（AB Vista公司技術總監）、Noel Sheehan（酶服務與咨詢公司經理）