中藥提取物的組方及其對致病性大腸桿菌的抑菌試驗

賀泂杰　賀奮義　郭慧琳

摘 要：通過試驗，篩選出毒性低，具有止瀉、退熱作用的中草藥黃連、黃芩、白頭翁、秦皮、鐵莧菜、四季青、苦參和穿心蓮等。根據(jù)其有效成分的性質(zhì)，對各藥有效成分進(jìn)行提取。將提取物按照一定的比例組成不同的配方，采用瓊脂平板稀釋法，對仔豬致病性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒株K99和本試驗室分離鑒定的O1、O2、O8、O138、O141、O78、K89進(jìn)行體外抑菌試驗，結(jié)果表明，配方四所含各提取物的含量最小，抑菌效果最佳。

關(guān)鍵詞：中藥提取物；組方；致病性大腸桿菌；體外抑菌

中圖分類號：S853 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）06-0050-02

大腸桿菌（Escherichia coli，Elcoli）又稱為大腸埃希菌，屬革蘭氏陰性桿菌，由Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的。大腸桿菌主要寄居在人體的大腸內(nèi)，常引起嚴(yán)重腹瀉，甚至敗血癥。當(dāng)它侵入人體其他一些部位時，可引起感染，如腹膜炎、膽囊炎等。目前臨床抑殺大腸桿菌仍以抗生素為主。但近年來大腸桿菌對多種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，特別是產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌，其耐藥率逐年有升高的趨勢。許多中草藥天然具有對大腸桿菌的抑制殺滅作用，其抗菌作用日益受到重視。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥材

黃連、黃芩、白頭翁、秦皮、四季青、鐵莧菜、苦參和穿心蓮，均購自蘭州市醫(yī)藥超市。將購買的中草藥用蒸餾水洗凈風(fēng)干，然后用電動粉碎機將其粉碎后備用。

1.1.2 試驗菌種

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒株（K99），購于中國獸藥監(jiān)察所。仔豬致病性大腸桿菌（O1、O2、O8、O138、O141、O78、K89）由平?jīng)鲐i場采集病料分離鑒定。

1.1.3 供試菌種培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，一般選用LB瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.4 主要儀器

生化培養(yǎng)箱，不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器，手動可調(diào)試移液器，電子天平，粉碎機，單人雙面凈化工作臺，電熱恒溫水浴鍋，電熱恒溫干燥箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 中草藥有效成分的提取

采用不同的提取方法對中藥有效成分進(jìn)行提取。

1.2.2 菌株復(fù)蘇及純化

用接種環(huán)分別蘸取8種不同的細(xì)菌，分別加入到裝有一定量LB液體培養(yǎng)基的帶塞試管中，做好標(biāo)記，放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)18 h。將配好的LB固體培養(yǎng)基放入微波爐中加熱融化，倒入培養(yǎng)皿中，厚度為5 mm左右，靜置讓其固化；用接種環(huán)分別蘸取8種不同的細(xì)菌，于培養(yǎng)皿中劃線以得到單個菌落，37 ℃于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h；用接種環(huán)挑取單個菌落移入裝有LB液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，置于溫箱中37 ℃震蕩培養(yǎng)以得到一定濃度的較純菌液。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，一般選用LB瓊脂培養(yǎng)基。營養(yǎng)瓊脂按說明，溶化高壓滅菌，冷卻45 ℃左右倒板，厚度為4 mm，備用。

1.2.4 菌液制備

用接種環(huán)分別蘸取純化的細(xì)菌，于培養(yǎng)皿中劃線培養(yǎng)以得到單個菌落；用接種環(huán)挑取單個菌落接種于2 mL LB培養(yǎng)液內(nèi)，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)6 h，1∶1 000倍稀釋備用。

1.2.5 中藥提取物的組方及其對致病性大腸桿菌的體外抑菌試驗

將硫酸黃連素、黃芩苷、白頭翁、秦皮、四季青、鐵莧菜、苦參和穿心蓮提取物按照不同的配伍和用量組成不同的配方進(jìn)行試驗研究。最后篩選出四個效果比較好的配方進(jìn)行試驗（表1）。

以上配方按照一定工藝加水至10 mL，調(diào)pH值7.5～8，制成10倍濃縮液，10磅高壓滅菌20 min，分別吸取經(jīng)滅菌的四種配方藥液1 mL、0.8 mL、 0.6 mL、0.5 mL、0.4 mL、0.3 mL、0.2 mL、0.1 mL到滅菌的平皿中，加入LB瓊脂培養(yǎng)基至10 mL，混勻，冷卻凝固后成梯度濃度含藥瓊脂平板，畫好分區(qū)，按照瓊脂平板稀釋法進(jìn)行四個配方對八種致病性大腸桿菌的體外抑菌試驗。

2 結(jié)果

2.1 中草藥有效成分的提取

針對各藥不同的化學(xué)有效成分，分別設(shè)計了對黃連、黃芩、白頭翁、秦皮、四季青、鐵莧菜和苦參中活性成分的提取工藝，提取獲得硫酸黃連素純品、 黃芩苷純品、30∶1白頭翁提取物、30∶1秦皮提取物、50∶1四季青、30∶1鐵莧菜提取物、20∶1苦參提取物和20∶1穿心蓮提取物。

2.2 中藥提取物的組方及其對致病性大腸桿菌的抑菌試驗

將硫酸黃連素純品、黃芩苷純品、30∶1白頭翁提取物、30∶1秦皮提取物、 50∶1四季青、30∶1鐵莧菜提取物、20∶1苦參提取物和20∶1穿心蓮提取物按照一定的比例進(jìn)行配伍，并按照瓊脂平板稀釋法進(jìn)行體外抑菌試驗，結(jié)果見表2。

由表2可見，配方二和配方四抑菌效果比較好，而以配方四所含各提取物的含量最小。

3 分析與討論。

3.1 將8味中藥提取物組方進(jìn)行體外抑菌活性試驗

四個配方均有明顯的體外抑菌作用。綜合分析，配方四所含各提取物的含量最小，抑菌效果最佳。

3.2 中草藥提取物的體外抑菌試驗

所得結(jié)論對臨床用藥只是起到一個理論指導(dǎo)作用。依據(jù)中獸醫(yī)學(xué)理論可知，一般單味藥的作用要比多味藥差，因為許多中草藥之間都具有協(xié)同相加的作用。藥物配伍適當(dāng)，能有效提高療效，減少藥品用量，降低成本，為中草藥的復(fù)方制劑研制及實踐應(yīng)用提供可能。

3.3 甘肅省是我國中草藥的主產(chǎn)區(qū)之一有豐富的資源優(yōu)勢

因此，應(yīng)用中獸醫(yī)理論，結(jié)合現(xiàn)代先進(jìn)的生產(chǎn)設(shè)備，探索科學(xué)的工藝流程，合理開發(fā)應(yīng)用這一資源，不僅在獸醫(yī)臨床上具有較好的治療價值，而且對養(yǎng)殖、種植戶脫貧致富奔小康具有現(xiàn)實意義。□□

參考文獻(xiàn)：（6篇，略）