格利特對(duì)模擬雞舍環(huán)境中禽流感病毒的殺滅效果

李亞雄　仇正興

摘 要：為驗(yàn)證在有機(jī)物存在下格利特消毒劑殺滅禽流感病毒的能力，試驗(yàn)?zāi)M雞舍和周圍環(huán)境的消毒實(shí)際情況，在雞糞中混入H9亞型禽流感病毒，研究格利特消毒劑（20 %戊二醛溶液）殺滅禽流感病毒的效果，結(jié)果：1∶100、1∶200和1∶400稀釋的格利特消毒劑在4 ℃或25 ℃下作用20 min，均能100 %殺滅混入雞糞中的H9N2禽流感病毒；1∶200稀釋的格利特消毒劑25 ℃下作用 20 min，能殺滅存在于雞糞和清潔劑中的100 %H9N2禽流感病毒。1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600稀釋的格利特消毒劑25 ℃下作用20 min，均能100 %殺滅無(wú)雞糞保護(hù)的H9N2禽流感病毒。結(jié)論：格利特消毒劑能殺滅有雞糞保護(hù)的禽流感病毒。

關(guān)鍵詞：消毒劑；模擬環(huán)境；稀釋度；禽流感病毒：殺滅作用

中圖分類號(hào)：S851.36 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2014）06-0068-02

消毒劑種類繁多，常用的消毒劑以成分分類主要有9種：含氯消毒劑、過(guò)氧化物類消毒劑、醛類消毒劑、醇類消毒劑、含碘消毒劑、酚類消毒劑、環(huán)氧乙烷、雙胍類消毒劑和季銨鹽類消毒劑。按消毒效果分類有3種：高效消毒劑、中效消毒劑、低效消毒劑。

不同種類的消毒劑因各自的作用原理和含量差異，具有各自的適用范圍和消毒濃度，超出適用范圍和濃度范圍，消毒效果變差甚至根本不能產(chǎn)生消毒效果。

人和動(dòng)物疫病時(shí)有發(fā)生，預(yù)防疫病發(fā)生有三種主要途徑：消滅傳染源、切斷傳播途徑和保護(hù)易感者。有的疫病已經(jīng)研制出疫苗，可以使用疫苗保護(hù)易感者，但很多為老病新發(fā)（病原發(fā)生了質(zhì)的變異）或新發(fā)傳染病，如2013年2月開(kāi)始在中國(guó)發(fā)生的H7N9禽流感疫情。

預(yù)防和控制流感病毒感染的措施主要集中在阻止病毒的入侵和入侵后控制病毒的進(jìn)一步傳播。流感病毒從呼吸道和消化道排出，污染的糞尿最有可能導(dǎo)致流感在禽群之間傳播。

消滅和減少雞舍和周圍環(huán)境中病原微生物的最好方法是打掃、清洗后（存在少許雞糞）消毒。我們知道：帶有雞糞等有機(jī)物的雞舍和周圍環(huán)境中禽流感病毒的殺滅并不是任何一種消毒劑均能奏效。為選擇用于帶有雞糞等有機(jī)物雞舍及其周圍環(huán)境中禽流感病毒消毒的消毒劑，我們查閱了有關(guān)資料，《禽病學(xué)》第十一版第153頁(yè)有如下記載：禽流感病毒（AIV）在一般環(huán)境中的穩(wěn)定性相對(duì)較差，通過(guò)改變物理因素即可使病毒失活。在有機(jī)物存在時(shí)，AIV能被化學(xué)試劑如醛類、β-丙內(nèi)酯和二乙基亞胺等滅活，除去有機(jī)物（消毒劑單獨(dú)與AlV作用），則可使用酚類、銨離子、氧化劑（如次氯酸鈉）、稀酸和羥胺來(lái)破壞AIV。根據(jù)以上敘述，我們選擇不同稀釋度的格利特消毒劑（20 %戊二醛溶液）來(lái)研究醛類消毒劑對(duì)AIV的殺滅效果。

1 材料

1.1格利特（GLUTEXTM）戊二醛溶液

規(guī)格 20 %（g/g），批號(hào)：YY00D8N001，生產(chǎn)日期：2013年8月23日（有效期：1年）。

1.2 9～10日齡SPF雞胚：

梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司供應(yīng)；

1.3 病毒

NJ01株H9N2亞型禽流感病毒尿囊液，病毒含量為107.0EID50左右，江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所家禽重大疫病防控研究室分離、保存。

1.4 立白洗潔精

廣州立白企業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，有效期至2014年7月22日。

1.5 0.22μm微孔濾膜過(guò)濾器

Millipore Ireland Ltd.產(chǎn)品。

1.6 雞糞便

取自試驗(yàn)雞場(chǎng)；生理鹽水：自配，pH6.8～7.0；自來(lái)水：取自自來(lái)水水管，pH6.8～7.0。

1.7 1 %雞紅細(xì)胞溶液

實(shí)驗(yàn)室自制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.8 LB固體培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)室自制。

1.9其他材料和儀器

固體石蠟、打孔器、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)等。

2 方法

2.1 病毒與消毒劑的稀釋

先將病毒進(jìn)行1∶1 000稀釋（因?yàn)樵瓉?lái)的病毒含量為106.5EID50，先1∶1 000稀釋后，接種時(shí)只需進(jìn)行10-1、10-2、10-3稀釋）；將格利特消毒劑用自來(lái)水稀釋為1∶33.4、1∶53.3、1∶66.7、1∶133.4、1∶266.7、1∶533.4（v/v）。

2.2雞糞+病毒+消毒劑

取雞糞100 g、病毒溶液100 mL攪拌混勻，分出4份，每份10 mL，其中3份分別加入5 mL 1∶33.4、1∶66.7、1∶133.4稀釋的格利特消毒劑，使雞糞∶病毒溶液∶消毒劑稀釋液比=1∶1∶1，將每份混合液搖勻后均分為2部分，一部分置4 ℃、另一部分置25 ℃下作用，20 min后取出離心過(guò)濾。第4份加入5 mL自來(lái)水，作為該組不加消毒劑的病毒含量測(cè)定對(duì)照，25 ℃下作用20 min后取出離心過(guò)濾。

2.3 病毒+消毒劑對(duì)照

取病毒溶液60 mL，加入60 mL自來(lái)水?dāng)嚢杌靹颍殖?份，每份10 mL，其中4份分別加入5 mL 1∶66.7、1∶133.4、1∶266.7、1∶533.4稀釋的格利特消毒劑，使自來(lái)水：病毒溶液：消毒劑稀釋液=1∶1∶1。第5份加入5 mL自來(lái)水作為病毒+自來(lái)水對(duì)照。均置25 ℃作用20 min后取出離心過(guò)濾。

2.4 雞糞+病毒+清潔劑+消毒劑

取雞糞50 g、病毒溶液50 mL、10 mL l：400稀釋的洗潔精溶液混勻，取出2份，每份11 mL，其中l(wèi)份加入4 mL 1∶53.3稀釋的格利特消毒劑，使雞糞∶病毒溶液∶洗潔精溶液∶消毒劑稀釋液=5∶5∶1∶4。將混合液搖勻后均分為2部分，1份置25 ℃作用，20 min后取出離心過(guò)濾。第2份加入4 mL自來(lái)水作為該組不加消毒劑的病毒含量測(cè)定對(duì)照，25 ℃作用20 min后取出離心過(guò)濾。

2.5 病毒+生理鹽水對(duì)照

取病毒溶液2 mL，加入4 mL生理鹽水混勻，25 ℃作用20 min后取出離心過(guò)濾。用于測(cè)定病毒在生理鹽水介質(zhì)中的病毒含量，與其它各對(duì)照組的病毒含量進(jìn)行比較。

為了清楚明了，將分組和稀釋結(jié)果概括見(jiàn)表1。

2.6 稀釋、接種和觀察

將以上所有過(guò)濾液用滅菌生理鹽水分別進(jìn)行10-1～10-3 的10倍倍比稀釋。病毒+生理鹽水對(duì)照進(jìn)行10-1～10-6的10倍倍比稀釋，每一份過(guò)濾液的各稀釋度均尿囊腔途徑接種3枚SPF雞胚，O.1 mL/枚，置37 ℃溫箱進(jìn)行孵化，每天上下午各照1次，死肝及時(shí)取出，至120 h將活胚取出凍死。

2.7收獲和檢測(cè)

無(wú)菌收取所有死胚和活胚的尿囊液，測(cè)定其血凝價(jià)（HA），另對(duì)36 h前死肝尿囊液進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

2.8病毒含量的計(jì)算

根據(jù)雞胚感染情況，計(jì)算各過(guò)濾液的病毒含量。

2.9消毒效果判定

根據(jù)有消毒劑作用組和無(wú)消毒劑對(duì)照組的病毒含量測(cè)定，判斷消毒劑的消毒效果。

3 結(jié)果

3.1雞胚感染比例

所有處理項(xiàng)的各稀釋度雞胚感染比例見(jiàn)表2，以HA≥ 2 log2判為感染。

3.2 病毒含量

根據(jù)雞胚感染情況，按Reed和Muench法計(jì)算出各處理項(xiàng)的病毒含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 結(jié)論

4.1 通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了《禽病學(xué)》第十一版153頁(yè)的觀點(diǎn)：在有機(jī)物（如雞糞）存在時(shí)，AIV

4.2在有雞糞保護(hù)的4 ℃或25 ℃下作用20 min，1∶400以下稀釋的格利特消毒劑能夠100 %殺滅雞糞中的AIV。溫度對(duì)格利特消毒劑消毒效果的影響很小。

4.3 25 ℃下作用20 min，1∶1 600以下稀釋的格利特消毒劑能夠100 %殺死無(wú)雞糞等有機(jī)物保護(hù)的AlV。

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