一種激光顯微拉曼光譜儀的設計和應用

周 凱 王曉榮 蔡 亮 趙天琦

(南京工業大學自動化與電氣工程學院1，江蘇 南京 211816;南京灼徽檢測技術有限公司2，江蘇 南京 211816)

0 引言

將光學顯微鏡與光纖拉曼光譜儀有機結合的分析方法稱為顯微拉曼光譜分析法。微區分析是顯微拉曼的主要應用范疇。相比于其他傳統方法，顯微拉曼更容易直接獲得大量的物質結構特征［1］。隨著顯微拉曼技術的日趨成熟，該技術在腫瘤檢測、文物考古等領域發揮著重要的作用。

隨著顯微拉曼技術的發展，拉曼光譜儀在微區分析方面的應用得到了拓寬。顯微拉曼應用于微區與表面分析可以獲得微區內分子振動信息，從而得到相關分子信息。這種分析方法快速簡便、分辨率高，適合微量樣品分析。因此，用于樣品微區無損分析的激光顯微拉曼光譜儀的研究具有十分重要的意義［2－3］。

1 顯微拉曼光譜技術的分析基礎

當光照射在介質上，除被介質反射、吸收和透射及瑞利散射外，還有一部分與入射光波長不同的散射光，稱之為拉曼散射光。光量子與物質分子相互碰撞，可以產生彈性碰撞和非彈性碰撞。在非彈性碰撞過程中，發生了能量交換。光量子不僅改變了運動方向，而且改變了光量子的頻率，這種散射現象稱為拉曼散射［4］。

拉曼光譜分析的特征量是拉曼頻移和散射強度。拉曼頻移是拉曼散射光相對于入射光頻率的變化量，是非彈性散射最主要的特征量，可以作為拉曼檢測中分子結構定性分析的理論基礎。拉曼光譜的強度與散射中心(包括基團和化學鍵)的數目成正比。在入射光的強度保持恒定的條件下，拉曼散射信號強度與待測物質濃度成正比，這正是拉曼光譜法進行定量分析的基礎。

拉曼儀器的共焦技術有兩種:一種是針孔共焦，又稱真共焦;另一種是簡單共焦，又稱贗共焦［5］。真共焦顯微技術的空間分辨率、抑制噪聲的能力都強于簡單共焦顯微技術，但是真共焦對機械穩定性要求很高，生產成本也很高。

根據實際需要，既可以選擇高性能、高成本的真共焦方式;也可以在滿足設計要求的情況下，選擇犧牲一部分空間分辨率的簡單共焦方式。

2 激光顯微拉曼光譜儀的設計

2.1 顯微拉曼的總體設計

顯微拉曼光譜儀主要由五個部分組成，分別是激光光源、顯微鏡采樣系統、外光路系統、光譜儀系統和計算機處理系統。新型激光顯微拉曼光譜儀的整體測量系統如圖1 所示［6－7］。

圖1 激光顯微拉曼測量系統Fig.1 Laser microscope Raman measurement system

激光光源的作用是提供單色性好、功率大、穩定性強的入射光。顯微鏡采樣系統實現兩個功能，首先在照明光源為白光時觀測待測物質的顯微圖像(即組成結構)，并找到最佳觀測位置;然后切換為激光入射，照射待測樣品。外光路系統首先將激光光源的輸出信號經過準直、濾光使之轉變為平行光引入顯微鏡，再將反饋回來的拉曼散射信號引向光譜儀。光譜儀系統包括光柵單色器和CCD檢測單元。光柵單色器的主要作用是將拉曼散射信號按波長在空間分開，CCD檢測單元用于收集前面分開的光信號并轉化為電信號。計算機處理系統完成從CCD檢測單元中讀取采集到的拉曼光譜數據，對獲取的原始拉曼光譜數據進行基線去除、求導、噪聲濾除等預處理，然后運用已建立的解析校正模型來進行拉曼光譜的定性、定量分析。

2.2 顯微鏡系統與光路設計

2.2.1 顯微物鏡的選擇

顯微物鏡是光學顯微鏡的最重要組成部分，它負責形成原始圖像，并發揮核心作用。常用的物鏡有三種，一種是消色差物鏡，可以校正兩種色光產生的色差;另一種是復消色差物鏡，其性能遠遠優于普通消色差物鏡，它能夠校正三種顏色的光線產生的色差;還有一種是平場物鏡，它能夠校正場曲，使整個像面為一個平面。這次設計對顯微鏡的圖像并不追求很高的光強，但為了看清樣品的內部結構，對圖像清晰度有一定的要求，因此我們選擇帶有常規平場消色差物鏡的顯微鏡［8］。

2.2.2 光學系統的選擇

適用于顯微拉曼光譜系統的顯微鏡必須是無限遠光場顯微鏡。與有限遠光學系統相比，無限遠光學系統中有一段由成像透鏡和物鏡構成的平行光線空間，這也正是無限遠光學系統使用越來越普遍的原因。這段平行光束理論上可以無限延長，因此，根據設計需要，可以加入各種光學附件。這些光學附件包括偏振光分離器、濾色鏡等。由于成像光束在平行光束之后，因此在平行光束中添加光學附件不會影響成像質量，大大簡化了物鏡的設計。

無限遠光學校正系統在無限遠光學系統的物鏡與成像透鏡之間加入其他光學附件，成像點的位置不變;而有限遠光學系統中，若是增減其他光學附件，會造成成像點的偏移。由此可見，只能選擇具有無限遠光學系統的顯微鏡進行切換設計，才能保證目鏡和攝像頭處的精確成像，而有限遠光學系統適用于各個元件固定不變的情況。遠光學校正系統示意圖如圖2所示。

圖2 遠光學校正系統示意圖Fig.2 Schematic diagram of the optical correction system

本次的光源切換裝置正是根據無限遠光學系統的原理，作為附加光學器件設計安裝在物鏡與成像透鏡之間，只用來改變光的方向，不影響成像點的質量。

2.2.3 顯微鏡的切換光路設計

基于以上對顯微鏡無限遠光學系統和顯微物鏡選擇的要求，設計了顯微鏡與外光路的切換光路［9］，其示意圖如圖3所示。

圖3 激光的引入與導出示意圖Fig.3 The diagram of laser introduction and export

本次設計采用的是一維空間濾波光路，因此對顯微鏡的光路設計并不困難。在顯微照明光路的末端，增設一面反射率高達99.5%的全反鏡和拉桿裝置。全反鏡以45°角放置在光路中，拉桿裝置實現激發光源(激光)和照明光源(鹵素燈光)的切換。由于光路的可逆性，樣品被激發后產生的拉曼信號經物鏡和鏡筒后成為平行光，沿原路返回。

2.3 外光路系統的設計

由于散射光與單根光纖耦合效率很低，采用多根收集光纖可以提高散射光與光纖的耦合效率，從而增加拉曼散射信號的收集效率。所以我們采用多光纖探頭的設計方案，外光路設計如圖4所示。

圖4 外光路設計圖Fig.4 Design of external optical path

設計的外光路系統主要包括:激發光纖、收集光纖束、準直透鏡、前置全息濾光片、反射鏡、后置全息濾光片、聚焦透鏡。

激發光纖用于將激光器發出的激光引入外光路。我們用準直透鏡準直激發光纖射出的激光，使之變為平行光。其中前置全息濾光片用于濾除激光器在產生激光過程中產生的其他波長的激光和譜線，使激光變得純凈，避免其他譜線對拉曼信號的干擾。反射鏡用于反射激發激光，使之射向顯微鏡。后置全息濾光片用于濾除散射信號中的瑞利散射，并使拉曼散射信號通過。聚焦透鏡則把拉曼散射信號聚焦，然后用光纖接頭SMA905將拉曼散射信號耦合至收集光纖束，導入光譜儀，從而完成對拉曼光譜儀顯微系統的外光路部分的設計［10］。

3 激光顯微拉曼光譜儀的應用

3.1 微區無損檢測

拉曼微區分析技術可進行空間分辨的原位無損檢測，為其他現代分析技術所不及。在固體檢測方面，該技術起著重要的作用，不需要制備樣品，使用非常方便。

選取彩霞石(又稱豬肉石)作為樣品，在顯微光譜儀下所得到的豬肉石的不同區域的拉曼譜圖如圖5所示。

圖5 彩霞石的拉曼譜圖Fig.5 Raman spectrum of pork stone

由圖5可以看出，兩條曲線都有明顯的上揚，而且在687點數處有明顯的出峰，所以可以判定這塊彩霞石為天然質地，非人造石。商家為了美觀，在石頭表面做過染料處理，因此產生了很強的熒光。

3.2 礦物檢測定性分析

拉曼光譜對樣品的結構和成分非常敏感，就像人的指紋一樣，因此可以用于樣品的定性分析。本課題對單一礦物、混合礦物分別進行了測定，通過比較測試結果與標準譜圖，可以判定未知樣品是何種物質。

單一礦物以螢石舉例，所測得的拉曼譜圖如圖6所示。混合礦物以輝銻礦方解石共生標本為例，樣品以及拉曼譜圖如圖7所示。通過與標準譜圖的拉曼譜圖比較可知，透明物質為方解石，深色物質為輝銻礦。

圖6 螢石的拉曼譜圖Fig.6 Raman spectrum of fluorite

圖7 混合礦物的拉曼譜圖Fig.7 Raman spectrum of mixed mineral

3.3 翡翠鑒定中的應用

在寶石、玉石翡翠的檢測鑒定方面，顯微拉曼有著不可替代的作用。天然翡翠的產出遠遠不能滿足市場需要，不法商家使用石蠟、環氧樹脂等有機高分子材料來填充原石，冒充優質翡翠。本課題對某商場購買的工藝品翡翠做拉曼分析，譜圖如圖8所示。翡翠拉曼譜圖既有天然翡翠的特征譜帶，又有石蠟的特征譜帶，說明此工藝品中有石蠟填充物存在，并不是優質的天然翡翠。

圖8 翡翠拉曼譜圖Fig.8 Raman spectrum of emerald

4 結束語

顯微拉曼光譜分析技術是一種基于顯微技術和拉曼散射效應的非接觸式光譜分析技術，具有無破壞、靈敏度高、檢測時間短、所需樣品少等優點，可以實現對物質的定性、定量分析。該技術已成為分析科學領域的熱點研究之一，被廣泛應用于材料科學、生物醫學、文物考古等領域。

本文首先介紹激光顯微拉曼光譜儀的總體結構;然后重點對其顯微鏡系統與光路設計進行了設計研究;最后，將激光顯微拉曼光譜儀應用于彩霞石的微區檢測。結果表明，顯微拉曼光譜儀的微區檢測可以實現樣品的定點檢測。將拉曼光譜技術用于對礦物檢測定性分析和翡翠的鑒定，通過每種礦物和翡翠的特征譜帶，可以快速判定礦物的種類和翡翠的真偽。

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