丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法的應用研究

時慧挺

丙型肝炎病毒(HCV)為通過血液或者是血液制品進行傳播的一種病毒, 在輸血過程中丙型肝炎病毒傳染為一個無法忽視的途徑, 已經受到了廣大醫學工作者和患者的重視。流行病學調查結果顯示HCV感染的發生率較高, 分布較廣, 出于對輸血引起HCV傳播進行控制的目的, 臨床需對獻血者展開抗-HCV檢測［1］。本次研究中出于對丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法的臨床應用效果進行分析探討的目的, 對230份陰性血液標本和230份質控血液標本展開了相關檢測, 并對其檢測結果進行了統計分析, 現匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本來源于2012年1月～2013年12月間本院血液篩查陰性標本, 抽取其中的230份作為研究對象,另收集230份質控標本。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 對以上統計460份血液標本展開相關檢測, 采取雙抗原夾心法對丙型病毒肝炎抗體進行檢測, 并對檢測結果進行統計分析。

1.2.2 檢測方法 所需試劑包括：吉比愛、Ortho 丙肝病毒抗體酶聯免疫診斷試劑, 除此外還需要ChironRIBA 確認試劑。

抗原制備：嵌合表位抗原經包涵體的形式表達, 利用離子交換層析方式展開純化, 而后經 Sephadex G-50 柱凝膠過濾收集, 經SDS-PAGE對抗原蛋白展開鑒定。

雙抗原夾心法：采取濃度為50 mmol/L的碳酸鹽緩沖液對抗原進行稀釋, 多肽抗原工作濃度為：結構區多肽15 lg/ml, NS4區多肽0.5 lg/ml, NS5區多肽0.25 lg/ml, 基因工程表達抗原工作濃度C7為1 g/ml, C11為1 g/ml。在每個孔中加入100 μl, 37℃條件下放置1 h, 而后在4℃冰箱中過夜保存,經濃度為30%的小牛血清PBST進行封閉, 每孔加入200 μl,在37℃條件下放置1 h, 將封閉液棄去, 取50 μl樣品稀釋液,每孔加5 μl, 37℃條件下放置30 min, 而后經PBST沖洗5次。取最適合的酶稀釋度, 經棋盤滴定法每孔加入50 μl工作濃度的酶標記抗原, 37℃條件下放置15 min, 經PBST沖洗5次,每孔加入50 μl底物緩沖液和50 μl顯色劑, 37℃條件下放置10 min, 充分顯色。而后每孔加入50 μl濃度為2 mol/L的硫酸,終止反應, 采取酶標儀在450 nm波長下對吸光度進行檢測,檢測結果≥臨界值者視為陽性, 反之為陰性。

2 結果

采取雙抗原夾心法對上述標本進行檢測后, 共檢出136份HCV抗體陽性標本, 有2份標本沒有檢出, 經ChironRIBA確認試劑檢測證實這2份標本均為陽性, 雙抗原夾心法檢測敏感性為98.55%。詳見表1。

表1 雙抗原夾心法與ChironRIBA 確認試劑檢測結果比較

3 討論

流行病學調查結果顯示［2］, HCV感染表現出顯著的世界性分布, 在我國HCV感染者約有4000萬, 血液傳播為其主要傳播途徑, 其中輸血為血液傳播的一種主要形式, 因此在對HCV感染血液傳播進行有效控制的過程中, 臨床需對獻血者展開抗-HCV檢測。現階段采取酶聯免疫吸附試驗對抗-HCV抗體進行檢測為臨床診斷HCV感染的主要手段。在實施抗-HCV酶聯免疫診斷時所需試劑均為二抗作酶結合物,由于血清中IgG的含量相對較高, 因此少量的特異吸附會引起假陽性結果的出現, 進而對診斷結果和準確性產生影響。

PCR法對HCVRNA進行檢測時, 可依據檢測結果對HCV感染進行早期診斷, 然而臨床實踐證實, 該方法相對費時、費力, 且試劑費用也較為昂貴, 臨床普及存在困難, 特別是在基層醫院, 因此對新型有效檢測方法進行開發具有很大的必要性, 對于HCV感染的診斷具有重要意義。

霍亂毒素B亞基融合蛋白表達系統通過可溶性可表達獲得CTB2HCV融合蛋白抗原, 適用于酶標記抗原的制備, 然而由于CTB與大腸桿菌熱不穩定性腸毒素B亞基(LTB)存在較強的免疫交叉反應, 人血清中LTB抗體含量較高, 可能對基于融合蛋白的雙抗原夾心ELISA系統產生較為嚴重的非特異性反應, 在大腸桿菌中表達了大腸桿菌噬體MS2DNA多聚酶與HCV抗原決定簇的融合蛋白, 將HRP標記的CTB2HCV融合蛋白決定簇的融合蛋白, 對雙抗原夾心的ELISA系統進行建立。

近幾年雙抗原夾心法在丙型肝炎病毒抗體檢測中逐漸被應用, 且取得了良好的效果, 曾有學者對269份HCV抗體陽性標本采取雙抗原夾心法進行檢測, 結果僅3份未檢出, 檢測敏感性為98.84%［3］。本次研究中對138份HCV抗體陽性標本進行檢測, 結果發現, 雙抗原夾心法檢出136份, 僅2份標本未檢出, 敏感性為98.55%, 與相關文獻報道結果接近。

因雙抗原夾心法不需要對血清產品進行稀釋, 不會受到類風濕因子等因素的干擾, 具有較高的特異性, 并且同時可以對血清中各類抗體進行檢測, 特別是IgM類抗體, 有效縮短了從病毒感染到經ELISA法檢出抗體之間的“窗口期”。因此采取雙抗原夾心ELISA法可以使HCV感染診斷試劑的特異性、檢出率得以顯著提高, 縮短了檢測時間, 臨床意義重大, 值得臨床關注并推廣。

［1］ 劉文玉.酶聯法檢測丙型肝炎病毒抗體陽性分析.白求恩軍醫學院學報, 2010,12(03):175.

［2］ 喬偉振.丙型肝炎病毒不同基因型NS3蛋白的抗原異質性分析.中華微生物學和免疫學雜志, 2009,10(01):151.

［3］ 張桂芳.溶血對雙抗原夾心法檢測HIV抗體的影響.實用醫學雜志, 2010,17(13):155.