含利塞膦酸骨水泥對SD大鼠成骨細胞OPG、RANKL和OC表達的影響

張玉彪，柳云恩，鞏天星，趙顯威，高燕，侯明曉

（1.沈陽軍區總醫院急診醫學部，沈陽 110016；2.全軍重癥（戰）創傷救治中心實驗室和遼寧省重癥創傷和器官保護重點實驗室，沈陽 110016；3.東北大學生命科學與健康學院，沈陽 110004；4.朝陽市喀左縣水泉鄉人民政府，朝陽 122000）

骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潛能，在體內和體外特定的誘導條件下可分化成骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經、肌腱及韌帶等組織。MSCs取材方便，可在體外大量擴增，與顆粒骨和磷酸鈣骨水泥的復合物聯合培養可作為人工骨移植物。1970年骨水泥開始應用于臨床［1］，各種骨水泥應運而生，目前，丙烯酸類樹脂骨水泥和磷酸鈣骨水泥是臨床填補骨缺損的主要材料［2，3］。磷硅酸鈣水門汀作為一種填充骨缺損的新型材料正處于臨床前階段［4，5］，尚未應用于臨床手術中。磷硅酸鈣水門汀（見圖1）具有良好的生物降解能力和延展性，具有臨床手術所使用的骨水泥的理化性質，在一定程度下隨著利塞膦酸（RA）含量的升高對骨具有促進愈合作用，將一定含量的磷酸二氫鈣（MCP）添加到含利塞膦酸的骨水泥中，能夠增加骨水泥的強度和凝固速度［6，7］。

本實驗所研究的骨水泥材料為納米級，通過含利塞膦酸的磷硅酸鈣水門汀的PBS浸提液對SD大鼠成骨細胞共同培養，然后提取細胞RNA進行熒光定量PCR試驗，研究OPG、RANKL和OC3個基因的相對表達量，進而對所研究的骨水泥進行分析評價，并闡述3個基因的相互關系，現報道如下。

圖1 磷硅酸鈣骨水泥顯微結構

圖2 成骨細胞生長3d圖片（×10）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生48h內SD大鼠胎鼠，由沈陽軍區總醫院動物實驗科提供。

1.1.2 試劑和儀器 試劑：0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司），Ⅱ型膠原酶（美國sigma公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），DMEM（美國Hyclone公司），TRIZOL（美國Cibco公司），反轉錄試劑盒（日本TARAKA公司），PCR擴增試劑盒（日本TARAKA公司），RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒（北京天根公司）。儀器：PCR擴增儀（美國Bio－Rad公司），核酸蛋白分析儀（美國 Thermo Scientific公司），熒光定量PCR儀（美國Bio－Rad公司），振蕩培養箱（美國Thermo Scientific公司），水平電泳槽（美國Bio－Rad公司），凝膠成像分析系統（美國Bio－Rad公司），恒溫金屬浴（杭州博日科技有限公司），超速高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）。

1.1.3 引物合成 OC上游引物F：TGCAAAGCC CAGCGACTCT下游引物 R：AGTCCATTGT TGAGGTAGCG擴增產物為98bp；OPG上游引物F：CGTCACCCACAGTCTGAGGAA下游引物R：TCAACTGCCATTTCAAGAGCC擴增產物為216 bp；β－actin上游引物 F：GAACCCTAAGGCCAAC CGTG下游引物R：AGGCATACAGGGACAAC ACAGC擴增產物為104bp；RANKL上游引物F：CCGTGCAAAGGGAATTACAAC下游引物R：GATGGTGAGGTGAGCAAACG擴增產物為134 bp，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 成骨細胞分離 用SD大鼠胎鼠提取成骨細胞；無菌取下胎鼠顱骨放入無菌PBS中浸泡并剔去骨膜等物質，將顱骨剪成泥狀轉移到15mL離心管中，加入5mL 0.25%胰蛋白酶，放入37℃5%CO2的培養箱中孵育45min，1 000r／min離心5 min，棄去上清液加入Ⅱ型膠原酶5mL，再放入37℃5%CO2的培養箱中孵育30min，1 000r／min離心5min，棄上清液收獲細胞，將細胞用10%胎牛血清的DMEM培養基培養，每2d換液一次，待細胞傳代至第3代時（見圖2），進行細胞鑒定，經鑒定為成骨細胞，純度適合本實驗［2］。

1.2.2 骨水泥浸提液的制備 骨水泥使用前160℃高溫干熱滅菌6h，制作1%RA骨水泥模型和15%MCP＋0.5%RA骨水泥模型，并以PBS為浸提液的介質分別浸泡7d。

1.2.3 細胞總RNA的提取 將細胞培養傳代至第3代，將細胞培養基以7∶1的濃度比與15%MCP＋0.5%RA骨水泥和1%RA骨水泥浸提液混合作為細胞培養基，置于6孔板中培養，每組6個平行，培養3d，待6孔板培養細胞匯合度為90%～100%時，提取細胞總RNA。將細胞用無菌PBS洗3次，加入1mLTRIZOL，適當搖動培養皿，將液體吸至1.5mL離心管中室溫靜置3～5min，然后加入0.2mL氯仿輕輕振搖15s，室溫靜置2～3min后4℃12 000rpm／min離心15min，取上清無色水相（0.5～0.6mL）吸到EP管中（DEPC處理過）加入0.5mL異丙醇，室溫下靜置10min。4℃12 000rpm／min離心10min，觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清液，加入75%的乙醇1mL洗滌（DEPC水新配制），4℃7 500rpm／min離心5 min，重復該操作2次。棄上清液用小Tip吸干液體，空氣中金屬浴55～60℃干燥沉淀5～10min，加入20～30uL DEPC處理水，用槍吹打均勻溶解總RNA。將上述得到的RNA在核酸蛋白分析儀上檢測260／280的OD值。將所提的RNA反轉錄成cDNA。

1.2.4 樣品OPG、RANKL、OC 和β－actin的熒光定量測定 引物序列由上海生工生物試劑有限公司合成，用熒光定量PCR儀進行RT－PCR反映。RTPCR擴增條件：95℃預變性5min，94℃變性10s，58℃退火10s，45個循環，每個循環72℃退火10 s，結束時采集熒光；反應完成后從55～95℃緩慢升溫，每個循環上升0.5℃，整個過程進行連續采集熒光，產生融解曲線，每組5個平行。以β－actin為內參基因，通過雙標準曲線法對含1%RA的磷硅酸鈣骨水泥浸提液和15%MCP＋0.5%RA的骨水泥浸提液進行相對表達量的測定，按照構建標準曲線的反應體系及反應條件進行。試驗結果以目的基因OPG、RANKL、OC和β－actin拷貝數的比值為目的基因mRNA的相對表達量。為分析不同分離株OPG、RANKL和OC基因表達量的差異，不加浸提液的成骨細胞為陰性，根據公式計算一個目的基因轉錄水平在不同cDNA樣品中相差的倍數。

1.3 統計學方法

運用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，1%RA骨水泥和含15%MCP＋0.5%RA骨水泥與對照組組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA質量檢測

用核酸蛋白分析儀檢測提取總RNA的260／280的OD值和RNA濃度，OD值均為1.8～2.0之間，證明所提取的RNA純度較高，滿足試驗要求，可以進行試驗，對RNA濃度進行定量，濃度均調整為80ng／uL。

2.2 OPG、RANKL和OC表達分析

15%MCP＋0.5%RA骨水泥浸提液和1%RA的骨水泥浸提液與空白對照組OPG、RANKL和OC基因的mRNA相對表達量的差異（見表1）。含1%RA的磷硅酸鈣骨水泥浸提液具有促進OPG、OC2個基因表達的作用，降低RANKL表達的作用（見圖3）。含0.5%RA和15%MCP的磷硅酸鈣骨水泥浸提液對OPG、OC2個基因具有促進表達的作用，對RANKL的表達作用不明顯（見圖4）。含有15%MCP的0.5%RA的骨水泥對成骨細胞OPG和OC的促進表達作用強于1%RA骨水泥，MCP能加速骨水泥的凝固，在浸提液制作過程中骨水泥顆粒不易浸出，含有RA的骨水泥藥物釋放過程中，骨水泥顆粒會浸出，由于本實驗骨水泥材料為納米級，可能會影響細胞的生長。

表1 骨水泥浸提液與空白對照組成骨細胞中OPG、RANKL和OC基因的差異表達

圖3 1%RA骨水泥浸提液成骨細胞OPG、RANKL和OC基因mRNA差異表達

3 討論

在調節破骨細胞分化、活化的多種細胞因子中，OPG通過阻斷RANKL的功能，抑制破骨細胞的分化及活化，誘導破骨細胞凋亡。RANKL的前體是RANK，RANKL被認為是介導破骨細胞分化和活化的關鍵因子，它能刺激破骨細胞的分化、活化，抑制破骨細胞凋亡，與OPG形成2個對立競爭的因子，破骨細胞的成熟及功能狀態可通過OPG與RANKL 的比值決定［8］。

圖4 15%MCP＋0.5%RA骨水泥浸提液成骨細胞OPG、RANKL和OC基因的mRNA差異表達

OC 屬于 γ－羧谷氨酸包含蛋白類（GLA proteins），是維生素K依賴性蛋白類，在骨礦化峰期之后該蛋白開始積聚，使用維生素K拮抗劑能夠使此蛋白在骨中的含量減少，對其脯氨酸的含量不產生影響，對骨的機械強度也不產生影響。根據骨鈣素的變化情況鑒別骨質疏松的轉換類型：老年性骨質中骨鈣素升高不明顯屬于低轉換型；絕經后骨質中骨鈣素水平明顯升高屬于高轉換型［9］。對骨中OC表達進行分析，可判定骨中含鈣量的高低，進而對骨質疏松的類型進行判斷，在研究中具有非常重要的意義［10］。

本試驗采用相對定量的方法，參比β－actin制備標準曲線，選用1%RA的骨水泥和含15%MCP＋0.5%RA的骨水泥DMEM培養基浸提液，浸提液與正常的DMEM培養基的比例為1∶7作為培養細胞的培養基，由于此比例對細胞具有弱毒性，培養3d后提取剩余60%～70%左右細胞的總RNA；以這2個濃度含藥量作為研究OPG、RANKL和OC的培養基，通過目的基因轉錄水平在不同cDNA樣品中相差的倍數，證實磷硅酸鈣骨水泥浸提液具有促進OPG、OC2個基因表達的作用；RA骨水泥具有降低RANKL表達的作用，添加MCP的RA對RNAKL表達作用不明顯；OPG和OC2個基因對成骨細胞的增值具有促進作用，增加骨鈣含量促進骨愈合。RANKL為破骨細胞標志性因子，骨水泥浸提液對破骨細胞生成具有抑制作用，說明RA對成骨細胞具有誘導分化作用［11，12］。

本實驗通過分子水平進行添加不同藥物的磷硅酸鹽骨水泥相關基因表達量的分析，闡述所研究材料在基因方面對成骨細胞增殖分化的相關性，含RA的磷硅酸鈣骨水泥可促進成骨細胞形成分化，抑制破骨細胞生長，對成骨細胞分化生長和骨愈合具有一定的促進作用，為臨床應用提供了一定的實驗數據。

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