注射用頭孢地嗪鈉生物安全性檢查標準研究

2014-06-04 13:00:52張良蒲旭峰張德波

成都醫學院學報 2014年3期

張良，蒲旭峰，張德波

（成都市藥品檢驗所，成都 610045）

頭孢地嗪是由德國發明的世界上第一個具有免疫增強功能的第三代頭孢菌素，其通過抑制細菌細胞壁的合成發揮殺菌作用，對革蘭陽性菌、陰性菌均有抗菌活性，對β內酰胺酶、頭孢菌素酶和青霉素酶極穩定，臨床主要用于鏈球菌屬、肺炎球菌等敏感菌所致的肺炎、支氣管炎、咽喉炎、扁桃體炎、腎盂腎炎、尿路感染、淋菌性尿道炎、膽囊炎、膽管炎、婦科感染、敗血癥及中耳炎等?！吨袊幍洹?010年版二部收載了頭孢地嗪鈉及其制劑－注射用頭孢地嗪鈉［1，2］。本研究是考查四川制藥制劑有限公司生產的仿制新藥注射用頭孢地嗪鈉的生物安全性質量是否達到《中國藥典》要求，并起草安全性檢查標準［3－11］，為其新藥申報提供依據。

1 實驗材料

1.1 藥品

由四川制藥制劑有限公司提供的注射用頭孢地嗪鈉，規格：1.0g，批號：121201、121202、121203；規格：2.0g，批號：121201、121202、121203。

1.2 試劑

鱟試劑：標示靈敏度（λ）0.25EU／mL，規格：0.1mL／支，批號：1108291；標示靈敏度（λ）0.125 EU／mL，規格：0.1mL／支，批號：1210121、1209231，湛江安度斯生物有限公司生產。標示靈敏度（λ）0.25EU／mL，規格：0.1mL／支，批號：11111112；標示靈敏度（λ）0.125EU／mL，規格：0.1 mL／支，批號：12082812，福州新北生化工業有限公司生產。細菌內毒素檢查用水，規格：50mL／支，批號1211020，含細菌內毒素＜0.003EU／mL，湛江安度斯生物有限公司生產。細菌內毒素工作標準品（凍干）效價 160EU／支，規格10支／盒，批號150601－201174，中國藥品生物制品檢定所提供。氯化鈉注射液，規格：500mL，批號：120713104，四川美大康佳樂有限公司生產。

1.3 動物

昆明種小鼠100只，清潔級，體質量17～21g，雌雄各半，雌性無孕；日本大耳白兔，普通級，體質量2.14kg，雄性，均由四川省實驗動物專委會養殖場提供。實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2008－14。鼠和兔的全價顆粒飼料，由四川省實驗動物專委會養殖場提供，其質量符合GB14924.1－2001《實驗動物配合飼料通用質量標準》。小鼠雌雄分開飼養，每籠5只；日本大耳白兔在標準兔籠中單獨飼養，動物使用許可證號：SYXK（川）2008－103。

2 方法與結果

2.1 異常毒性檢查

2.1.1 小鼠LD50測定采用Bliss法測定，取本品1批（1.0g，121203），用氯化鈉注射液溶解并配制成0.110g／mL、0.130g／mL、0.153g／mL、0.180 g／mL、0.212g／mL的供試液；選取體質量為19～21g的小鼠，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，靜脈注射0.8mL／只測定。

測定結果：LD50（半數致死量）：5.9403g／kg，X50（半數致死對數劑量）：0.7738，SX50（標準誤）：0.0192，LD50的95%可信限（L95）：5.4462～6.4791 g／kg。

回歸方程Y：Y＝－5.1185＋13.0763×log（D），即：測得本品LD50＝5.94g／kg；LD50的95%可信限為5.45～6.48g／kg。

2.1.2 異常毒性檢查劑量設定《中國藥典》2010年版二部附錄XIX M《化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則》中對異常毒性限值設定，建議限值采用小于LD50可信限下限的1／4～1／8作為檢查劑量，因此本品異常毒性檢查限值可設定在1／4LD50～1／8LD50之間，即1.36 ～0.68g／kg?！吨袊幍洹?010年版二部收載的“注射用頭孢地嗪鈉”異常毒性檢查，供試液為0.1g／mL，按靜脈法給藥，即給藥劑量為2.5g／kg，約相當于本品LD50的95%可信限下限的1／2。因此本品異常毒性檢查劑量設定為藥典標準中規定的劑量2.5g／kg。

2.1.3 異常毒性檢查供試液的溶血與凝聚考查

取家兔心臟血，脫纖，離心洗滌至上清液不顯紅色，取分離紅細胞用0.9%氯化鈉注射液配成2%的混懸液備用。取本品加氯化鈉注射液溶解并配制成0.1g／mL的溶液，依法操作。

結果：陰性和陽性管均成立，供試品管上層液與供試液顏色對照管（第4管）的溶液顏色接近，供試液未引起溶血與凝聚作用。即本品異常毒性檢查的供試液不會引起溶血與凝聚作用。

2.1.4 異常毒性檢查試驗取3批樣品（規格2.0 g），分別加氯化鈉注射液溶解并配制成0.1g／mL的溶液。取健康合格，體質量為17～20g的昆明種小鼠15只，雄性，分為3組，按靜脈注射法分別給予相應的供試液，每只小鼠給藥0.5mL，給藥時間5 s，給藥后立即觀察（見表3）。

表3結果顯示：給藥后產生毒性反應的動物能在2min內完全恢復正常，給藥后觀察72h內均未出現死亡，且無異?，F象。

2.1.5 異常毒性檢查質量標準試驗表明，本品可以建立藥典規定的異常毒性檢查標準，給藥劑量設定為2.5g／kg。取本品，加氯化鈉注射液制成0.1 g／mL的溶液，依法檢查（《中國藥典》2010年版二部附錄XIC），按靜脈注射法給藥。

2.2 細菌內毒素檢查

2.2.1 鱟試劑靈敏度復核以細菌內毒素檢查用水溶解內毒素工作標準品，并配制成含內毒素2.0 λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ系列濃度的溶液，依法進行加樣操作。每一濃度平行做4支，同時用細菌內毒素檢查，用水做2支陰性對照，記錄結果，并按式λC＝antilg（∑X／4）計算λC值（見表4）。

表4結果表明：每一批鱟試劑靈敏度測得值均在0.5～2.0λ范圍內，符合要求。復核的鱟試劑可按標示靈敏度值使用。

2.2.2 樣品內毒素限值（L）的確定本品臨床［用法用量］：靜脈注射，1.0g溶于4mL注射用水，或2.0g溶于10mL注射用水中，于3～5min內注射；靜脈滴注，1.0g或2.0g溶于40mL注射用水、生理鹽水或林格氏液中，20～30min內輸注（摘自本品臨床使用說明書）。故本品臨床使用的最大劑量為2.0g／（60kg·1h）計

本品臨床使用需用注射用水、生理鹽水或林格氏液溶解，溶解液中含有一定內毒素；同時參考《中國藥典》2010年版二部“注射用頭孢地嗪鈉”細菌內毒素檢查標準，為了臨床用藥安全，將本品內毒素限值定為L＝0.10EU／mg。

2.2.3 干擾試驗預試驗取樣品1批（規格1.0g，批號：121202），用細菌內毒素檢查用水配制成10 mg／mL、5mg／mL、2.5mg／mL、1.25mg／mL、0.625mg／mL、0.3125mg／mL一系列濃度的供試液，依法操作進行試驗（見表5）。

預試結果顯示：本品供試液配制成＞1.25mg／mL濃度可能對內毒素與鱟試劑的反應有抑制性干擾作用；供試液配制成≤1.25mg／mL濃度對反應可能無干擾。

2.2.4 供試品干擾試驗取本品規格為1.0g的樣品3批，加細菌內毒素檢查用水溶解并分別制成2.5mg／mL、1.25mg／mL濃度的供試液，然后分別用供試液和細菌內毒素檢查用水分別復溶鱟試劑，各分為4列，每列4支。2種溶液復溶的鱟試劑的4列安瓿中相同方法分別加入含細菌內毒素工作標準品2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的4種濃度溶液，同時各設陰性對照管2支，37℃恒溫進行反應60min。觀察結果，并按Es＝antilg（∑X／4），Et＝antilg（∑X／4）計算Es和 Et（見表6、表7）。

表6顯示：3批樣品配制成2.5mg／mL濃度，用湛江安度斯生產的鱟試劑試驗，Es、Et均在0.5～2.0λ之間，且Et／Es＝1，表明2.5mg／mL 濃度供試液對反應完全無干擾作用；用福州新北生產的鱟試劑試驗，Es、Et均在0.5～2.0λ之間，但Et／Es＝2，表明2.5mg／mL濃度供試液對反應有一定的抑制性干擾作用。

表7顯示：3批樣品配制成1.25mg／mL濃度，用湛江安度斯生產的鱟試劑進行試驗，結果Es、Et均在0.5～2.0λ之間，且 Et／Es＝1，表明1.25 mg／mL濃度供試液對反應完全無干擾作用；用福州新北生產的鱟試劑試驗，Es、Et均在0.5～2.0λ之間，Et／Es＜2，表明1.25mg／mL濃度供試液對反應基本無干擾作用。

2.2.5 細菌內毒素檢查質量標準取本品，用細菌內毒素檢查用水配制成含頭孢地嗪≤1.25mg／mL的溶液，依法檢查（《中國藥典》2010年版二部附錄XI E），頭孢地嗪中含內毒素的量＜0.10EU／mg。2.2.6 樣品內毒素驗證檢查取供試品3批（規格2.0g），用細菌內毒素檢查用水溶解并配制成濃度1.25mg／mL，用λ＝0.125EU／mL鱟試劑（批號：1209231），按起草標準進行檢查。每批試驗取鱟試劑8支，每支加入0.1mL細菌內毒素檢查用水溶解后，其中2支加入0.1mL供試液作為供試品管，2支加入用細菌內毒素檢查用水配制的2.0λ內毒素工作標準品液0.1mL作為陽性對照管，2支加入細菌內毒素檢查用水0.1mL作為陰性對照管，2支加入0.1mL供試品陽性對照溶液（用同1支內毒素工作標準品配制成的含2.0λ濃度的內毒素及含供試品的溶液）作為供試品陽性對照管。加完樣分別輕輕混勻，垂直放入（37±1）℃試管恒溫儀中，保溫60min，取出，緩緩倒轉180°，觀察結果。結果實驗均成立，供試品管呈陰性；3批樣品的細菌內毒素檢查符合規定。