TGF-β1/Smad信號(hào)通路在皮膚病理性瘢痕及瘢痕癌組織中的變化*

劉進(jìn)輝，李明華，白曉龍，李宏偉，宋 斌

(吉林省人民醫(yī)院燒傷整形科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

皮膚瘢痕的形成是由于機(jī)體炎癥反應(yīng)，膠原的合成與降解不平衡、異常粘多糖的出現(xiàn)以及纖維細(xì)胞的增生所造成。從廣義上來(lái)講，沒(méi)有疤痕就沒(méi)有創(chuàng)傷的愈合。疤痕組織的主要成分是纖維蛋白。疤痕組織膠原的產(chǎn)生和沉積增加了傷口的強(qiáng)度，從一般意義上來(lái)說(shuō)是有益的。如果疤痕組織形成不充分，受損組織得不到正常的張力，由此可以引發(fā)許多并發(fā)癥，如腹壁切口愈合的疤痕薄弱，在腹內(nèi)壓的作用下可使疤痕處重新裂開(kāi)或腹內(nèi)容物逐漸向外膨出而形成腹壁疝。相反，如果疤痕過(guò)度形成，就可造成嚴(yán)重的外形或功能上的重要問(wèn)題。因而疤痕相對(duì)于損傷前組織來(lái)說(shuō)，總是一個(gè)不完善的替換。從機(jī)械角度來(lái)看，其抗強(qiáng)性減弱;從營(yíng)養(yǎng)角度來(lái)看，造成了氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交流的障礙;從功能角度看，引起受損組織的畸形和功能障礙，從美觀角度看，造成了外形的破壞。部分病理性瘢痕具有增殖性，其呈現(xiàn)持續(xù)生長(zhǎng)亢奮表現(xiàn)，患者可出現(xiàn)瘙癢難忍甚至疼痛破潰出血等癥狀，病理性瘢痕不但影響患者的美觀、生理功能，且在長(zhǎng)期受壓、持重、牽拉、摩擦、抓癢等不良刺激影響下有癌變可能［1-3］。

創(chuàng)傷傷口愈合經(jīng)過(guò)上皮化環(huán)節(jié)后，TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成纖維細(xì)胞內(nèi)被激活，使體內(nèi)合成和分泌更多的TGF-β1受體，靶基因被持續(xù)性啟動(dòng)，又由于TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路與細(xì)胞基質(zhì)沉淀以及纖維化密切相關(guān)，通路被過(guò)度激活后導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)被過(guò)度沉淀，最終形成疤痕。在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上Smad是該通路中藥的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，可將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核，筆者現(xiàn)將不同瘢痕組織標(biāo)本進(jìn)行TGF-β1/Smad信號(hào)通路標(biāo)志性因子蛋白和基因的檢測(cè)，以期為瘢痕癌治療提供新的臨床思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料：標(biāo)本來(lái)源于本院2009年1月至2013年2月病理科。20份病理性瘢痕組織標(biāo)本設(shè)為觀察A組，其中男性11例，女性9例，年齡29-81歲，平均(42±5.32)歲，來(lái)源部位：頭面部9例，上肢6例，下肢5例，均有疤痕形成史。20份標(biāo)本均經(jīng)過(guò)HE染色及光鏡檢查確診為瘢痕癌;20份瘢痕癌組織標(biāo)本設(shè)為觀察B組，其中男性10例，女性10例，年齡30-81歲，平均(42±7.11)歲，來(lái)源部位：頭面部8例，上肢7例，下肢4例，臀部1例，疤痕形成原因：火燒傷11例，電擊2例，油燙傷7例;20份正常皮膚組織設(shè)為對(duì)照組，其中男性11例，女性9例，年齡31-82歲，平均(43±6.91)歲，部位：頭面部7例，上肢8例，下肢3例，臀部2例。三組標(biāo)本在年齡、性別、來(lái)源部位等一般情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 免疫組化

1.2.1.1 標(biāo)本制作：采用SP法進(jìn)行標(biāo)本形態(tài)學(xué)的檢測(cè)，標(biāo)本脫蠟、水化后使用PBS洗2-3次各5min，將3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10min，PBS洗2-3次各5min;抗原修復(fù);PBS洗2-3次各5min;滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min。甩去多余液體。滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1h或者4℃過(guò)夜或者37℃1h。4℃過(guò)夜后需在37℃復(fù)溫45min。PBS洗3次各5min;滴加Ⅱ抗40-50μl，室溫靜置，或37℃1h;Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20。PBS洗3次各5min;DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度;PBS或自來(lái)水沖洗10min;蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化;自來(lái)水沖洗10-15min;脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.1.2 結(jié)果判定［4］：TGF- β1 陽(yáng)性表達(dá)是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均出現(xiàn)棕色顆粒，而Smad陽(yáng)性表達(dá)是細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒;每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)著色細(xì)胞與未著色細(xì)胞的比值(陽(yáng)性率)。根據(jù)陽(yáng)性率×染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積將免疫組化組織細(xì)胞陽(yáng)性等級(jí)分為4個(gè)等級(jí)：陰性：積分＜2分;弱陽(yáng)性：積分波動(dòng)于2-3分之間;陽(yáng)性：積分波動(dòng)于4-6分之間;強(qiáng)陽(yáng)性：積分＞6分。

1.2.2 Western blotting

1.2.2.1 試劑：SDS-PAGE試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)膜緩沖液、膜染色液、包被液、顯色液購(gòu)于廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司

1.2.2.2 提取蛋白和檢測(cè)：取不同組別皮膚組織200mg，利用蛋白酶抑制劑提取總蛋白。100℃金屬浴中變性后，進(jìn)行SDS電泳(4%濃縮膠，12% 分離膠，120V，50mA，1.5h)，用 PVDF 膜轉(zhuǎn)印.5%脫脂奶粉液的封閉2h后，分別加入抗TGF-β1、Smad和β-actin抗體(1：1000)，4℃孵育過(guò)夜，次日加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1：2000)室溫2h。加入顯色液，計(jì)算機(jī)掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國(guó)).分析處理。

1.2.3 Real-time PCR

1.2.3.1 試劑

1.2.3.2 試劑：dNTP、Pfu酶均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程公司，基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2.3.3 提取RNA：三組組織的標(biāo)本各100mg加入500μL的Trizol試劑(Invtrogene公司)和100μL的氯仿，均勻混合后置于離心機(jī)進(jìn)行14000r/min轉(zhuǎn)速的離心10min，將上層水相置于新的EP管后加入同等體積將 RNA沉淀，干燥后加入10μL用DEPC處理去離子水溶解RNA沉淀，置于-80℃保存。

1.2.3.4 引物設(shè)計(jì)：針對(duì)國(guó)內(nèi)TGF-β1、Smad的基因片段保守區(qū)域，根據(jù)美國(guó)基因庫(kù)(GenBank)收錄的基因序列，表1的引物由廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司合成并標(biāo)記，擴(kuò)增Ct值利用lightcycler熒光定量PCR儀配備軟件進(jìn)行分析。Real-Time PCR操作方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用GAPDH作為內(nèi)部參照，將GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，通過(guò)ABI7000軟件獲得檢測(cè)指標(biāo)Ct(cycle threshold)值，與同樣本中GAPDH的Ct值相減，即獲得該樣本中相應(yīng)指標(biāo)的ΔCt值。以對(duì)照組ΔCt值作為校正，軟件根據(jù)2-ΔΔCT數(shù)值計(jì)算得出檢測(cè)指標(biāo)基因濃度水平。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司完成。具體序列見(jiàn)表1。

表1 TGF-β1、Smad及GAPDH引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所得所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖像分析所產(chǎn)生數(shù)據(jù)用(±s)進(jìn)行表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析法進(jìn)行分析描述，組間兩兩比較采用LSD法進(jìn)行，用等級(jí)相關(guān)(Spearman)分析變量之間的相關(guān)性，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1的蛋白表達(dá)：TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有棕黃色顆粒，正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌中的表達(dá)分別為陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性，其表達(dá)水平、表達(dá)強(qiáng)度在三者之間有差異(FPA=165.93，F(xiàn)OD=98.65，P ＜0.01)，觀察B組蛋白表達(dá)水平高于觀察A組和對(duì)照組(P＜0.05)，觀察A組和對(duì)照組之間蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。進(jìn)行Western blotting檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌三組TGF-β1的蛋白灰度值的表達(dá)水平呈遞增式(FPA=113.25，P ＜0.01)，觀察 B 組蛋白表達(dá)水平高于觀察A組和對(duì)照組(P＜0.05)，觀察A組和對(duì)照組之間蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。具體見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 三組TGF-β1蛋白表達(dá)情況

2.2 Smad的蛋白表達(dá)：Smad陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中均有棕黃色顆粒，正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌中的表達(dá)分別為弱陽(yáng)性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性，其表達(dá)水平、表達(dá)強(qiáng)度在三者之間有差異(FPA=99.94.93，F(xiàn)OD=78.49，P＜0.01)，觀察 B 組蛋白表達(dá)水平高于觀察A組和對(duì)照組(P＜0.05)，觀察A組和對(duì)照組之間蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。進(jìn)行Western blotting檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌三組Smad的蛋白灰度值的表達(dá)水平呈遞增式(FPA=102.89，P＜0.01)，觀察B組蛋白表達(dá)水平高于觀察A組和對(duì)照組(P＜0.05)，觀察A組和對(duì)照組之間蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。具體見(jiàn)圖 3，圖 4。

2.3 Real-Time PCR 結(jié)果：觀察 B 組 TGF-β1、Smad基因表達(dá)水平高于觀察A組和對(duì)照組(P＜0.05)，觀察A組和對(duì)照組之間TGF-β1、Smad基因表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

圖2 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

圖3 三組Smad蛋白表達(dá)情況

圖4 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

表2 三組標(biāo)本之間TGF-β1、Smad基因表達(dá)情況

2.4 皮膚瘢痕癌中TGF-β1、Smad表達(dá)的相關(guān)性：經(jīng)過(guò) Pearson相關(guān)分析，在皮膚瘢痕癌標(biāo)本中TGF-β1與mRNA TGF-β1(r=0.727 P ＜0.01)，Smad 與 mRNA Smad(r=0.812 P ＜0.01)的表達(dá)均呈正相關(guān)。

3 討論

皮膚受損后愈合要經(jīng)歷炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期，在此修復(fù)過(guò)程中TGF-β全程參與。皮膚受損后機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)趨勢(shì)大量血小板脫顆粒在傷處聚集，隨后TGF-β對(duì)大量單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，隨之大量單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞被趨化至皮膚傷處，TGF-β通過(guò)自分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)方式維持其在有效作用的濃度范圍內(nèi);另一方面，TGF-β還可超化炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，超化炎性細(xì)胞在傷口聚集，可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分泌，而超化成纖維細(xì)胞，可達(dá)到刺激多種基質(zhì)蛋白膠原基因的轉(zhuǎn)錄，兩者均可達(dá)到愈合傷口的最終目的［5-7］。

經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)大量研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad信號(hào)通路能抑制和分化角質(zhì)細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞分泌的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)組織損傷具有明顯的促進(jìn)修復(fù)和保護(hù)作用，TGF-β1/Smad信號(hào)通路在一定程度上削弱了角質(zhì)細(xì)胞修復(fù)組織的作用，Annes JP［8］等對(duì)燒傷小鼠進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)Smad3基因敲除的小鼠體內(nèi)的角質(zhì)細(xì)胞分裂更快，燒傷創(chuàng)面感染率下降，傷口愈合恢復(fù)更為迅速，這一結(jié)果提示TGF-β信號(hào)通路通過(guò)Smad蛋白抑制角質(zhì)細(xì)胞的增殖而影響傷口組織愈合。加快傷口創(chuàng)面重上皮化過(guò)程，減少基質(zhì)的沉淀和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，可減少傷口愈合過(guò)程中肉芽組織的形成數(shù)量，這是傷口愈合的理想方式。

在多數(shù)人類腫瘤患者中存在TGF-β受體和Smad基因的過(guò)度表達(dá)的現(xiàn)象，有報(bào)道［9］認(rèn)為TGF-β蛋白的增殖與皮膚癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，TGF-β受體蛋白的表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度是評(píng)估皮膚腫瘤程度的一個(gè)標(biāo)志性分子生物因子，本研究結(jié)果顯示，瘢痕癌患者的TGF-β蛋白和基因的表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度均高于正常皮膚組別和病理性瘢痕組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明TGF-β受體的蛋白和基因在瘢痕癌標(biāo)本中的高表達(dá)可能與瘢痕癌的發(fā)生相關(guān)，其發(fā)生機(jī)制可能與TGF-β1影響組織纖維化進(jìn)程的特質(zhì)相關(guān)：TGF-β1可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生沉淀，其中最為明顯的是刺激成纖維細(xì)胞而導(dǎo)致粘連蛋白基質(zhì)的沉積，另一方面TGF-β1可降低蛋白酶的活性，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解過(guò)程，導(dǎo)致肉芽組織大量形成而促進(jìn)病理性瘢痕形成，而后惡化成瘢痕癌［10］。

Smad是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的標(biāo)志性蛋白，Smads家族蛋白在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用，TGF-β1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激后，TGF-β1型受體被磷酸化，與下游的Smad2/Smad3相互識(shí)別編碼后被活化，與此同時(shí)與Smad4結(jié)合成由異源寡聚體形成的復(fù)合體，繼而發(fā)生核轉(zhuǎn)移，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核后啟動(dòng)靶基因，促進(jìn)靶基因的啟動(dòng)和轉(zhuǎn)錄。2006年Haiyan等［11］使用蛋白免疫印跡法和RT-PCR法觀察TGF-β1刺激細(xì)胞周期以及對(duì)其下游Smad蛋白家族因子基因的表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩細(xì)胞模型的Smad基因表達(dá)量高于正常模型細(xì)胞組別，提示了TGF-β1促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度表達(dá)而導(dǎo)致瘢痕的途徑。本研究結(jié)果顯示，瘢痕癌患者的Smad蛋白和基因的表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度均高于正常皮膚組別和病理性瘢痕組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明Smad的蛋白和基因在瘢痕癌標(biāo)本中的高表達(dá)可能與瘢痕癌的發(fā)生相關(guān)。這一結(jié)果與Haiyan等所得結(jié)論一致。在相關(guān)性分析中我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1、Smad的蛋白和基因的表達(dá)均升高，且兩者呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明在皮膚瘢痕癌的發(fā)生過(guò)程中，TGF-β1、Smad發(fā)揮了協(xié)同作用，再者，由于TGF-β1、Smad是TGF-β1/Smad信號(hào)通路的標(biāo)志性因子，故筆者認(rèn)為瘢痕癌的發(fā)生過(guò)程中，TGF-β1/Smad信號(hào)通路具有重要關(guān)系，應(yīng)作為治療的新思路，對(duì)燒傷后瘢痕的預(yù)防提出新方法提供靶方向。

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