蝙蝠葛堿對阿爾茨海默病小鼠腦組織形態學的影響

張朝穎，費洪新，張英博，賈博宇，韓玉生，杜 徽，白 云，樸成玉，周忠光

（1.哈爾濱醫科大學 附屬第四醫院，哈爾濱150001;2.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是目前許多國家常見的老年性疾病，主要的機制是腦組織部位出現淀粉樣物質的沉積，淀粉樣物質的主要成分是β－淀粉樣蛋白（Amyloid beda，Aβ）［1］。Aβ 的沉積會引起機體氧化反應，腦組織形態學的改變，主要引起的是與機體學習記憶密切相關的部位，例如海馬部位、顳葉皮質區域的改變［2，3］。蝙蝠葛堿（Dauricine，DAU）具有廣泛的生物學作用，如抗氧化作用［4］、腦缺血保護作用［5，6］等。基于此本試驗采用APP/PS1雙轉基因AD小鼠模型，研究DAU對AD小鼠腦組織的保護作用。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

3月齡雄性、APP/PS1雙轉基因小鼠（B6.Cg－Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/Mmjax）、體重23 ±2g，由哈爾濱醫科大學解剖教研室吳樹亮教授贈送，并進行基因鑒定。動物常溫、常濕飼養，自由攝取食物。另外做對照的小鼠是同月齡、同背景小鼠，由黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心李寶龍副教授購買提供。

1.2 主要藥物

吡拉西坦購于湖南迪諾制藥有限公司，批號130325;DAU購于 MUST公司，批號 MUST—13010313，純度為98.66%;其他試劑均為國產分析純。

2 試驗方法

2.1 動物一般狀態觀察

該品種小鼠一般狀態觀察包括進食、飲水、體重、毛發、色澤、活動度、光澤度、糞便顏色、墊料潮濕度等指標。

2.2 動物分組

選擇AD小鼠18只，分3組，其中模型組6只、治療組6只、DAU組6只，另設立同月齡、同背景的C57小鼠對照組6只。

2.3 動物給藥

每天上午選擇對照組小鼠6只給予生理鹽水灌胃。模型組6只給予生理鹽水灌胃。治療組6只給予吡拉西坦（0.62 g·kg－1·d－1）灌胃。DAU 組 6 只給予 DAU（20 mg·kg－1·d－1）灌胃，持續2W。

2.4 多聚甲醛固定

小鼠乙醚麻醉、剪開腹腔、胸腔、右心耳，針頭插入左心室，緩慢勻速對小鼠灌注生理鹽水，肝變白后緩慢勻速灌注4%多聚甲醛50 mL，斷頭取腦組織固定。

2.5 制備石蠟切片

小鼠灌注固定后流水沖洗、脫水、透明、包埋、－20℃冰箱冷凍組織、切片5μm、做成石蠟切片。

2.6 動物腦組織HE染色

石蠟切片脫蠟、脫水、水洗、蘇木精染10 min、沖洗、鹽酸乙醇分化數秒、水洗、氨水處理、水洗、伊紅染色、水洗、脫水、透明、干燥、樹膠封片、顯微鏡觀察腦組織顳葉皮質和海馬的結構。

2.7 統計學分析結果

3 結果

3.1 動物一般狀態觀察

對照組小鼠活動自如，逃避反應靈敏，皮膚光滑，無瘀斑，毛色光亮，飲食飲水正常。模型組小鼠活動能力下降，怕冷，受到刺激躲避反應較差，不活躍，皮膚松弛。治療組小鼠，皮膚較光滑，活躍，較模型組改善明顯。DAU組小鼠狀態比較活躍，飲食飲水正常，反應較靈敏。

3.2 動物腦組織HE染色

3.2.1 顳葉皮質區域HE染色

腦組織對照組顳葉皮質神經元形態正常，細胞核清晰可見，細胞質豐富（見圖1A）。模型組顳葉皮質神經元較小，細胞核較小，細胞質不豐富（見圖1B）。治療組神經元比較正常，排列較規則（見圖1C）。DAU組神經元變性的數目較少，神經元基本正常（見圖1D）。

圖1 小鼠腦組織顳葉皮質HE染色（高倍鏡10×40）Fig.1 M ouse cerebral tem poral lobe cortex HE staining（High magnification 10×40）

3.2.2 海馬區域HE染色

腦組織對照組錐體細胞層數較多，神經元錐體形，細胞排列緊密，細胞核和細胞質清晰可見（見圖2A）。模型組錐體細胞層數減少，細胞變性明顯，可見到細胞核固縮（見圖2B）。治療組和DAU組細胞形態和排列方式均得到明顯的改善（見圖2C、2D）。

圖2 小鼠腦組織海馬HE染色（高倍鏡10×40）Fig.2 M ouse hippocampal brain tissue HE staining（High magnification 10×40）

4 討論

生物體衰老的過程是極其復雜的變化過程，其中自由基的反應在其中起到很重要的作用，自由基的大量產生使機體產生氧化的物質，這些物質會引起腦組織的損傷，腦組織損傷后神經元的結構就會發生改變［2］。DAU具有抗氧化的作用，因此本試驗主要研究DAU對腦組織因抗氧化引起的的形態學變化，觀察腦組織顳葉皮質和海馬的神經元形態結構。

針對AD模型很多，包括 D－半乳糖加亞硝酸鈉［7］、APP/PS1雙轉基因［8］等模型對機體的癡呆進行研究。本試驗采用APP、PS1兩個基因同時轉入C57小鼠的癡呆模型進行研究，觀察DAU對APP/PS1雙轉基因的形態學影響。試驗中觀察了各組小鼠的生長狀態，顯示該品種小鼠對飼養條件要求很高，需要清潔的飲用水，飼料和墊料專門購買，即使如此，該小鼠生長也非常緩慢。

試驗中對小鼠進行了心臟灌注、石蠟切片、常規的HE染色，染色結果顯示小鼠腦組織的結構變化。顳葉皮質區域經過HE染色顯示腦組織對照組顳葉皮質神經元形態正常，細胞核清晰可見，細胞質豐富。模型組顳葉皮質神經元較小，細胞核較小，細胞質不豐富。治療組神經元比較正常，排列較規則。DAU組神經元變性的數目較少，神經元基本正常。

試驗對海馬區域HE染色顯示腦海馬組織對照組錐體細胞層數較多，神經元錐體形，細胞排列緊密，細胞核和細胞質清晰可見。模型組錐體細胞層數減少，細胞變性明顯，可見到細胞核固縮。治療組和DAU組細胞形態和排列方式均得到明顯的改善。綜上所述，DAU可以維持AD小鼠腦組織神經元正常的形態結構，減輕AD的臨床癥狀，從而保護AD小鼠的腦組織結構。

［1］WU Y L，XIN X J，XIN X L，et al.Research progress about the regulation of GXXXG structures in the Alzheimer-related protein［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（1）:1—4.

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［3］PEREIRA AG，PORTUGUEZ MW，DACOSTA DI，et al.Route learning performance:is ita hippocampus function?［J］.Cognitive and Behavionral Neurology，2011，24（1）:4—10.

［4］何麗婭，李立中，吳基良.蝙蝠葛堿的抗氧化實驗研究［J］.中草藥，1997，28（8）:479—481.

［5］李艷紅，黃向江，盧浩浩.蝙蝠葛堿對大鼠局灶性腦缺血及線粒體氧化損傷的保護作用［J］.華中科技大學學報（醫學版），2005，34（3）:270—273.

［6］李艷紅，龔培力.蝙蝠葛堿對實驗小鼠腦缺血的保護作用［J］.中國藥理學通報，2004，20（5）:564—567.

［7］何勝，玉瑩，陳菊芳，等.D－半乳糖加亞硝酸鈉建立癡呆癥小鼠模型和中藥治療的效果［J］.中國老年學雜志，2014，34（2）:422—424.

［8］周妍妍，劉艷麗，董春雪，等.五味子醇甲對APP/PS1雙轉基因癡呆模型小鼠腦組織突觸素、α－突觸核蛋白表達的影響［J］.中國藥理學通報，2013，29（8）:1076—1079.