多個地區不同來源山夫登堡沙門菌分子分型研究

易勝杰，許學斌，李浩，梁蓓蓓，楊超杰，王建，邱少富，宋宏彬

多個地區不同來源山夫登堡沙門菌分子分型研究

易勝杰，許學斌，李浩，梁蓓蓓，楊超杰，王建，邱少富，宋宏彬

目的研究不同地區、不同來源山夫登堡沙門菌之間的傳播關系，并分析其耐藥情況。方法對分離的70株山夫登堡沙門菌采用K-B紙片擴散法分析其耐藥性，并通過脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）分子分型技術進行山夫登堡沙門菌的聚類分析。結果70株山夫登堡沙門菌對于大多數抗生素耐藥性較低，但是對于磺胺異噁唑，耐藥和中介耐藥的菌株達到了60%以上。同時還出現了3株對頭孢噻呋耐藥的菌株。PFGE結果分析顯示70株山夫登堡沙門菌可分為42個不同的PFGE帶型。北京市、上海市、南京市的部分菌株，有人、食品和環境3種不同來源，表現出完全相同的PFGE帶型，親緣關系十分密切。結論山夫登堡沙門菌具有遺傳多態性，可能在環境、食品和人之間相互傳播，應該加強監測，防止其進一步擴散。

山夫登堡沙門氏菌；耐藥性；脈沖場凝膠電泳；分子分型

沙門菌是世界上食源性腹瀉最常見的病原菌之一。每年全球因沙門菌感染引起的腸胃炎有9380萬，且8000多萬是由于食源性感染引起，因此而死亡的人高達15萬[1]。在發達國家，包括歐洲和美國，沙門菌在食源性細菌感染中一直是引起疾病最多的細菌之一[2-3]。而在我國，每年僅因食源性非傷寒沙門菌感染人數就達到903.5萬[4]。山夫登堡沙門菌作為一種較為常見的沙門菌血清型，在國內外都出現過人和動物感染病例以及污染食物和環境的報道[5-9]。我們通過對全國沙門菌的監測，在2005—2011年從多個地區分離到了不同來源的70株山夫登堡沙門菌。為了探究這些沙門菌變異變遷的關系，以及它們在人、食物、環境之間相互傳播的特點，我們運用脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）進行分型研究，并分析其耐藥情況。

1 對象與方法

1.1 菌株來源基于軍隊傳染病病原監測平臺，從各軍區疾病預防控制中心及其哨點醫院收集腹瀉臨床標本，分離獲得部分菌株。其他菌株來自上海市疾病預防控制中心對上海地區沙門菌的監測。

1.2 主要試劑與儀器主要為營養瓊脂、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（selenite cystine broth，SC）、沙門-志賀（Salmonella Shigella,SS）瓊脂。藥物敏感紙片和MH瓊脂購自英國Oxoid公司和北京路橋公司，其他為Api 20E生化板條（法國生物梅里埃）、沙門血清型診斷血清（日本生研）、20 mg/ml蛋白酶K（德國默克Merck）、限制性內切酶XbaI（日本TaKaRa）和PFGE瓊脂糖SeaKem Gold Agarose（美國Rock-land）、脈沖場電泳儀CHEFMapper PFGE system及其配套設備（美國Bio-Rad）、Bio-rad Quantity One凝膠成像系統（美國Bio-Rad）、臺式高速離心機（德國Eppendorf）、濁度儀（意大利Bio-Merieux）和Bio-Numerics 6.01分析軟件（比利時Applied-Maths）。

1.3 細菌分離鑒定及藥物敏感試驗樣品先由SC和SS瓊脂等選擇培養基進行初篩，然后通過生化板條和血清進行最終確認。按WHO推薦的改良K-B法進行操作，并按照美國臨床實驗室標準化委員會制定的藥物敏感試驗抑菌環標準進行判讀[10]，選用14種抗生素包括四環素、氯霉素、環丙沙星、氧氟沙星、磺胺異噁唑、磺胺甲噁唑甲氧芐啶、甲氧芐氨嘧啶、奈啶酸、氨芐西林、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻呋、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢噻甲羧肟。大腸埃希菌ATCC 25922作為質控菌。

1.4 PFGE實驗和分析PFGE實驗步驟嚴格按標準操作流程[11]。①膠塊制備：用棉簽刮取瓊脂平板上適量的新鮮菌落于細胞懸濁液，用濁度儀測菌液濁度至4.2。取該菌液400μl到1.5ml離心管，37℃孵育5min，加入20mg/m l的蛋白酶K 20μl及54℃預熱的含1%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）的低熔點瓊脂糖SeaKem Gold Agarose 400μl，加入模塊，室溫下凝固。將膠塊置于蛋白酶K的細胞裂解液混合液，54℃水浴搖床中振蕩孵育2 h以上。然后用預熱的純水洗2次，TE緩沖液洗4次。②膠塊內DNA酶切：從膠塊中切下2mm樣品，浸入200μl XbaI酶切體系中，37℃水浴作用3 h以上。③加樣及電泳：電泳條件為電壓6 V/cm，脈沖參數2.16～63.80 s，電泳溫度14℃，電泳時間20 h。使用沙門菌H9812作為對照。④電泳圖像獲取：用溴化乙錠溶液染色30min后，純水脫色4 h以上，在凝膠成像系統中獲取電泳圖像。

1.5 統計學處理PFGE結果采用BioNumerics分析軟件中非加權組平均法進行聚類分析，條帶位置差異容許度選擇1.0%，優化值選擇0.5%，使用Band based/Dice方法計算不同菌株電泳條帶的相似性系數。

2 結果

2.1 菌株分布70株山夫登堡沙門菌中，61株（87.1%）來自于上海市、6株（8.6%）南京市、3株（4.3%）北京市。其中54株（77.1%）分離于人糞便樣本，10株（14.3%）分離于各種食品，另外6株（8.6%）分離于環境水。菌株時間分布為2005—2011年，見圖1。2005年最少（2株），2008年最多（18株），其他年份分布較為平均。

圖1 70株山夫登堡沙門菌時間分布Figure 1 Temporal distribution of 70 Salmonella enterica serotype Senftenberg isolates

2.2 藥物敏感性（藥敏）結果分析70株山夫登堡沙門菌的藥敏結果見表1。藥敏結果顯示，70株山夫登堡沙門菌對不同抗生素的耐藥性表現出顯著的差異，菌株對于大多數抗生素的耐藥率和中介耐藥率都低于10%，但是對于磺胺異噁唑，耐藥和中介耐藥的菌株達到了60%以上。70株山夫登堡沙門菌對頭孢類和喹諾酮類藥物敏感性較高，但是也出現了3株對頭孢噻呋耐藥的菌株。

2.3 PFGE結果分析通過BioNumerics軟件分析可將70株山夫登堡沙門菌分為42個不同的PFGE帶型（圖2）。按照90%的相似度，這些PFGE帶型可以分為9個大小不一的聚類群，聚類A是最大的1個聚類群，包括19株山夫登堡沙門菌，其中1株分離于北京市，6株屬于南京市，其余都屬于上海市。值得注意的是，有2株菌分別分離自水源和食品，它們與8株人源山夫登堡沙門菌具有完全一致的PFGE帶型。聚類B中包括15株菌，其中4株從食品中分離而來。其他的聚類群包含的菌株數都較少，另外2株來自北京市的菌株形成了1個聚類，而2株2008年的上海市食源菌株與其他菌株的帶型差異較大。

3 討論

沙門菌在自然界中分布廣泛，可在人、動物、食品和環境中相互傳播，是引起食物中毒和感染性腹瀉最常見的致病菌之一[12]。山夫登堡沙門菌也可通過污染環境、食品等感染人和動物[5-8]，給公共衛生安全帶來潛在威脅。而探究不同地區不同來源山夫登堡沙門菌間的親緣進化關系，對于非傷寒沙門菌的全面的監測和防控十分重要。目前，PFGE技術已被成功地用于山夫登堡沙門菌的分子分型與親緣關系研究，并取得了較好的效果[6,13-14]。

表1 70株山夫登堡沙門菌藥敏實驗結果Table1 Antim icrobial susceptibility results of 70 Salmonella enterica serotype Senftenberg isolates

圖2 山夫登堡沙門菌脈沖場凝膠電泳聚類分析Figure 2 Cluster analysis of Salmonella enterica serotype Senftenberg by PFGE

本研究利用PFGE技術對我實驗室分離保存的70株山夫登堡沙門菌進行了分子分型，以探究不同地區不同來源山夫登堡沙門菌的變異變遷與傳播關系。PFGE結果顯示，70株山夫登堡沙門菌具有遺傳多態性，共分成了42個不同的PFGE帶型，表現出了較高的分辨率。按照90%的相似度，它們可以分為9個大小不一的聚類群，其中聚類A和聚類B分別包含19株和15株菌株，明顯多于其他聚類，是2種較為優勢的PFGE帶型。

聚類A的菌株分離于北京市、上海市、南京市3個地區，PFGE帶型相似度在90%以上。根據1995年Tenover等[15]提出的菌株同源性判別標準，當有1～3條帶的差別時，菌株為同一克隆，在流行病學上認為它們密切相關，菌株間存在非常近的親緣關系。這表明聚類A可能是跨區域流行的1個山夫登堡沙門菌亞群。菌株的分離時間跨越了2006—2011中的5個年份，提示它們可能一直都是較為優勢的山夫登堡亞群，已經較好地適應了環境。另外，1株水源和1株分離自食品的山夫登堡沙門菌與其他8株人源菌株表現出完全相同的PFGE帶型，這些菌株親緣關系十分密切，很可能是同源菌株在環境、食品和人中相互地播散。正是由于這種特性，導致它們更容易范圍性地播散，給公共衛生安全帶來巨大威脅。目前已經在國外出現過山夫登堡沙門菌大范圍的流行和暴發[16-17]，并且現在地區之間的聯系和交流越來越緊密，我們也應該加強對山夫登堡沙門菌的監測，警惕這支沙門菌亞群大范圍的播散。

而聚類B中的山夫登堡沙門菌都分離于上海市，表明聚類B更有可能為上海地區的一個流行亞群。聚類B中有4株菌從食品中分離而來，還有1株從污水中分離而來。3株食源、1株人源的菌株和污水分離來的菌株表現出完全相同的PFGE帶型。以上結果顯示，同一山夫登堡克隆可能在污水、食物和人中能相互傳播，這與聚類A中的分析結果一致。因此，通過對環境和食品中山夫登堡沙門菌的監測有利于我們分析它們導致人感染事件發生的傳播途徑，指導我們開展正確的防治措施。

從耐藥情況上來看，70株山夫登堡沙門菌對多種抗生素表現出高敏感性，但是對磺胺異噁唑耐藥性很高，這可能與抗生素的使用和此類耐藥基因容易在群體中擴散有關。雖然這些菌株對頭孢和喹諾酮類藥物耐藥性不高，但是也出現了3株對頭孢噻呋耐藥的菌株。目前沙門菌感染首選藥物是復方磺胺、環丙沙星、頭孢噻肟等，本研究結果表明目前的治療方案較為合理有效。

本研究結果表明，加強不同地區和不同來源山夫登堡沙門菌的監測有利于研究它們之間傳播和變異變遷的關系，指導我們做出正確的預防和控制措施。并且山夫登堡沙門菌還有流行暴發的潛在威脅，我們應該做好該類病原體的監測工作，防止山夫登堡沙門菌進一步擴散。

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（2014-08-15收稿 2014-09-25修回）

（責任編委 王永怡 本文編輯 張云輝）

M olecular subtyping of Salmonella enterica serotype Senftenberg from different regions and sources

YISheng-jie,XU Xue-bin,LIHao,LIANG Bei-bei,YANG Chao-jie,WANG-Jian,QIU Shao-fu*,SONG Hong-bin*
College of Basic Medical Sciences,Central South University,Changsha 410078,China
*Corresponding author.QIU Shao-fu,E-mail:qiushf0613@hotmail.com;SONG Hong-bin,E-mail:hongbinsong@263.net

Objective To study the relationship among the Salmonella enterica serotype Senftenberg isolates recovered from different regionsand sourcesand analyze their antimicrobialsusceptibilities.Methods Antimicrobial susceptibilitiesof70 Senftenberg isolateswere performed by K-B disk diffusionmethod,and pulsed field gel electrophoresis（PFGE）molecular subtypingmethod was applied to analyze their genetic relationships.Results Seventy isolates displayed low resistant rates for most antibiotics,but for sulfafurazole,resistant and intermediate resistant isolates reached more than 60%.Additionally,3 isolates displayed resistance to ceftiofur.The results of PFGE analysis showed that 70 isolates could be divided into 42 different PFGE patterns.Some isolates from Shanghai,Beijing and Nanjing,which were isolated from human,food and environment respectively,showed the exactly same PFGE pattern.The results suggested that they had a close relationship.Conclusion Salmonella enterica serotype Senftenberg displays genetic polymorphism and may infect human by the contaminated environment and food.We should enhance surveillance and avoid further dissemination of this pathogen.

Salmonella enterica serotype Senftenberg;antimicrobial susceptibility;pulsed field gel electrophoresis;molecular subtyping

R378.22；R181.2

A

1007-8134(2014)05-0292-04

國家“十二五”科技重大專項（2012ZX10004215）；國家自然科學基金（81202252、81373053）

410078長沙，中南大學基礎醫學院（易勝杰）；100071北京，軍事醫學科學院疾病預防控制所（易勝杰、李浩、梁蓓蓓、楊超杰、王建、邱少富、宋宏彬）；200336，上海市疾病預防控制中心（許學斌）

邱少富，E-mail:qiushf0613@hotmail.com；宋宏彬，E-mail: hongbinsong@263.net