高速逆流色譜分離制備龍膽中龍膽苷

何長英

湖南省郴州市第三人民醫院藥劑科 湖南郴州 423000

高速逆流色譜分離制備龍膽中龍膽苷

何長英

湖南省郴州市第三人民醫院藥劑科 湖南郴州 423000

目的:龍膽中龍膽苦苷的分離制備和含量測定。方法:采用HPLC測定龍膽中龍膽苦苷的含量和HSCCC分離制備龍膽苦苷;HPLC條件:以甲醇、0.1%磷酸溶液(甲醇:0.1%磷酸溶液=24:76)為流動相;流速1mL/min;檢測波長270nm;進樣量10μL，柱溫25oC。結果:經測定，龍膽草中龍膽苦苷的含量為0.5411%。選出正丁醇－水(1:1)為最佳溶劑體系，固定相保留率36.0%，分配系數0.714，上相作固定相，下相作流動相，轉速為850r/min，主機正轉，流速2mL/min，分離制備出的龍膽苦苷經HPLC檢測，純度可達98%以上。結論:HSCCC儀器性能可靠、分析成本低、易于操作，可分離制備出高純度的龍膽苦苷。

高速逆流色譜;高效液相;龍膽苦苷;分離制備

龍膽為常用中藥，中醫取其苦寒之性，瀉肝膽實火，除下焦濕熱。在臨床上，龍膽是龍膽瀉肝湯、瀉青丸、當歸龍薈丸等方劑的主藥，具瀉肝膽實火、清下焦濕熱之功。近年來用于健胃、抗腫瘤、治療急慢性肝炎、乙型腦炎、甲狀腺機能亢進等疾病亦取得良好療效。

目前國內外對龍膽屬植物的化學成分做了大量的分離鑒定、藥理和臨床研究，龍膽含有龍膽苦苷(gentiopic2rin)、當藥苷(sweroside)、當藥苦苷(swertiam a rin)等裂環環烯醚萜苷類、生物堿、黃酮、甾體、香豆素、內酯、糖及其苷類，酚性成分、微量元素、鞣質、蛋白質、揮發油、油脂類等化合物成分［1］。龍膽苦苷為其主要有效成分，且含量最高，被《中國藥典》定為龍膽的質量控制目標成分，具有抗菌、抗炎、健胃和保肝利膽等作用［2－6］〕。其結構式如下

本文主要采用HPLC對HSCCC溶劑體系的分配系數的測定值和固定相保留率的測定值為依據，進行溶劑系統的篩選。再對HSCCC的轉速和體積流量進行單因素考察，找出HSCCC最佳的轉速和體積流量，以分離制備出高純度龍膽苦苷。

1.儀器與試藥

1.1 儀器

KQ－250DE型超聲波清洗器

JMF－320多級閃蒸器

RE－3000旋轉蒸發儀

SHZ－D(Ⅲ)型循環水式真空泵

DK－98－1型電熱恒溫水浴鍋

GZX－DH－50X55－S型電熱恒溫干燥箱

高效液相色譜系統

TBE－300B高速逆流色譜儀

FA1104N電子天平

1.2 試藥

龍膽苦苷標準品(純度＞98%)批號為0912056，購自上海融禾醫藥科技有限公司;甲醇為色譜純(美國fisher公司)乙醇、正丁醇、正己烷、乙酸乙酯、冰醋酸、乙酸銨均為分析純，HPLC用水為娃哈哈純凈水。龍膽草產地為吉林。

2.實驗方法

2.1 超聲波提取

對原料龍膽草進行切段，段長1～2 cm，用天平稱取切段后的龍膽草1 kg，用5倍體積乙醇常溫浸泡12 h后，在25℃，250 W的條件下超聲提取30 min，將提取溶液采用布氏漏斗進行過濾。以上操作重復3次，合并其濾液濃縮至浸膏［7］，真空干燥成粉末，制備后的龍膽苦苷樣品儲存于冰箱中備用。

2.2 HPLC測定龍膽苦苷的含量

2.2.1 色譜條件及系統適應性試驗

色譜柱:Tigerkin ODS3(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇－0.1%磷酸溶液(24:76);檢測波長:270 nm;流速:1.0 ml/min;進樣量:10 μl;柱溫:30℃。此色譜條件下，分離度＞1.5，理論塔板數在4000以上。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取10 mg龍膽苦苷標準品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇超聲溶解，用甲醇定容，配制成1mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取龍膽提取物粉末50 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容配制成1 mg/mL的供試品溶液，超聲提取15 min，冷卻至室溫，用微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液，備用。

2.3 HSCCC色譜條件

正丁醇－水(1:1)為溶劑體系，轉速為850 r/min，然后以2 ml/min的流速泵入流動相，待流動相流出兩相溶劑在柱中達到平衡狀態時，通過進樣閥注入樣品，進樣量0.200mg/20mL，280nm處紫外檢測器進行檢測，記錄色譜圖，收集流分。

3 結果與討論:

3.1 超聲波提取

計算得到龍膽草中龍膽苦苷的含量為0.5411%。

3.2 HPLC測定龍膽苦苷含量

3.2.1 檢測波長的確定

取龍膽苦苷對照品溶液1.5 ml，以甲醇為空白，在紫外分光光度計下進行掃描，波長范圍200～600 nm。結果表明，龍膽苦苷在270 nm波長處有最大吸收，故選擇270 nm作為檢測波長。

3.2.2 HPLC色譜條件的摸索

本實驗曾選取不同比例的甲醇－水、甲醇－0.1%冰醋酸溶液、甲醇－0.2%乙酸銨溶液、甲醇－1%乙酸銨溶液、甲醇－0.1%磷酸等溶液作為流動相，以龍膽苦苷對照品及上述龍膽提取物在各條件下的分離度、理論塔板數為依據，最終確定最佳HPLC色譜條件為:色譜柱:Tigerkin ODS3(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇－0.1%磷酸溶液(24: 76);檢測波長:270 nm;流速:1.0 ml/min;進樣量:10 μl;柱溫:25℃。最佳條件下龍膽苦苷對照品及龍膽草樣品色譜圖。見圖1、圖2。

圖1 龍膽苦苷對照品(Figure 1 gentiopicroside reference substance)

圖2 龍膽苦苷樣品(Figure 2 Sample gentiopicroside)

3.2.3 加樣回收率實驗

精密稱取9份龍膽提取物粉末，每份2.5 mg，分別置于5mL容量瓶中，加少量的甲醇超聲溶解，再分別加入龍膽苦苷的對照品溶液0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，以相同的色譜條件進樣，測得結果如表3所示。

表1 回收率實驗(n=9)(Table 3Test for recovery)

3.2.4 龍膽苦苷樣品含量測定

按供試品溶液制備方法，制備3批龍膽苦苷提取物，按最佳色譜條件進行含量測定，結果見表4。

表2

3.3 HSCCC分離龍膽苦苷

3.3.1 溶劑系統篩選

溶劑系統的選擇是高速逆流色譜應用的關鍵，采用高效液相色譜對高速逆流色譜溶劑體系的分配系數的測定值和固定相保留率的測定值為依據，進行溶劑系統的篩選。實驗結果如表4、表5，

(1)以龍膽樣品中龍膽苦苷在溶劑體系中的分配系數為參考依據進行篩選，按下列公式計算:

分配系數=溶質在固定相中的濃度CS/溶質在流動相中的濃度CM結果如表5所示:

表3

根據分配系數在0.5－2的范圍內分離效果較好的原則選擇進行高速逆流色譜分離。

(2)以溶劑體系的固定相保留率為參考依據進行溶劑的篩選，按下列公式計算:

固定相保留=(柱外流通管的死體積一管柱中推出的流動相體積)/管柱總體積

結果如表6所示:

表4

3.3.2 有效成分的分離

在最佳HSCCCC條件下。龍膽苦苷出峰時間為120.0－133.6min，固定相保留率36%，高速逆流色譜圖(圖4)

3.3.3 HPLC鑒定與檢測純度

將高速逆流色譜儀在120.0－133.6min收集到的組分HPLC檢測，記錄色譜圖，并與龍膽苦苷對照品在同條件下的色譜圖進行對比，確定HSCCC分離到得物質為龍膽苦苷，見圖5和圖6。

4.小結

通過含量測定得到龍膽草中龍膽苦苷的含量為0.5411%。采用高速逆流色譜分離制備龍膽中龍膽苦昔，研究試驗得出:以正丁醇－水(1:1)為溶劑系統，上相作固定相，下相作流動相，轉速為850 r/min，固定相保留率36%，主機正轉，流速2 mL/min，龍膽苦昔出峰時間為120.0－133.6 min，經HPLC檢測，純度可達98%以上，是目前分離龍膽苦苷的首選方法，簡便、快速、純度高。

圖3

圖4 龍膽苦苷的對照品(Figure 7 the reference substance gentiopicroside)

圖5 龍膽苦苷樣品(Figure 8 Sample gentiopicroside)

［1］宋·唐慎微.重修政和經史證類備用小草［M］.卷六.北京:人民衛生出版社，1957:163.

［2］孔增科.實用中藥手冊［M］.天津:天津科技出版社，1996:83.

［3］王寧.秦嶺龍膽化學成分的定性分析［J］.青海大學學報(自然科學版)，2004，22(6):1－2.

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R943.1

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