微觀結構與組織工程絲素支架研究進展

孫晴晴，劉源崗，3，王士斌，何鵬

（1華僑大學化工學院化工與制藥工程系，福建 廈門 361021；2華僑大學化工學院生物工程與技術系，福建廈門 361021；3華僑大學生物材料與組織工程研究所，福建 廈門 361021）

組織工程融匯醫學、生物學和工程學等學科，是近年來的研究熱點之一。研究者利用工程學方法制造仿生結構，模擬天然組織的生理環境，包括結構的、物理的以及形態的特征。其中微觀結構對最終的組織構建起著至關重要的作用[1]。

目前關于組織工程相關材料的研究相對較多，包括合成材料與天然材料，合成材料如Poly Lactic Acid（PLA）、Poly（L-glycolic acid）（PGA）、Poly（lactic-co-glycolic acid）（PLGA）等，天然材料如膠原蛋白、彈性蛋白、殼聚糖等。其中絲素蛋白纖維作為一種天然的蛋白質纖維具有良好的生物相容性、氧和水蒸氣滲透性、生物可降解性、力學性能強等優點而被廣泛應用于組織工程，如骨組織[2]、軟骨組織[3]、軟體組織[4]、角膜[5]、血管[6]、宮頸組織[7]和皮膚[8]等。為了促進絲素組織工程的發展，考慮到微觀結構對細胞在支架內的增殖、黏附、向內生長形成組織、營養物質及代謝產物的良好運輸等產生的影響，本文將以絲素支架在組織工程中的不同結構為主線，對絲素的不同結構進行總結歸納，分析不同結構的優缺點，以期為今后從微觀結構角度設計絲素組織工程支架提供一定的參考依據。

1 絲素蛋白

家蠶蠶絲（Bombyx mori silk）以其獨特的力學性能和光澤度而受到廣泛關注，且被用作醫學縫合線已達數百年之久。近年來，因其具有良好的水溶性、生物相容性、易于化學修飾、體內降解較慢等特性而被用作生物材料。

家蠶蠶絲是熟蠶在蛻變時分泌絲液凝固而成的連續長纖維，由絲素蛋白和包裹在其外部的絲膠構成。絲膠是黏附蛋白，占蠶繭總質量的 25%～30%。絲素蛋白分子量（≥200～350 kDa）較大，包含輕鏈（Mw約 26 kDa）和重鏈（Mw約 390 kDa），兩條鏈由一個二硫鍵連接，同時一個 25 kDa的糖蛋白（P25）也以非共價鍵的形式與這些鏈相連[9]。絲素蛋白是一種嵌段共聚物，主要含有親水性的 β折疊所形成的嵌段，嵌段之間由一些小的親水片段相連。結晶區基本上是由Gly-X（X為Ala，Ser，Thr，Val）重復序列構成，在這些區域中存在一些富含甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪胺酸的子域[10]。絲素蛋白中的β折疊使其具有較高的力學性能和韌性，研究表明，蠶絲纖維的斷裂拉伸強度高達740 MPa[11]。

絲素蛋白除了具有良好的力學性能外，還具有良好的生物降解性，其降解速率與絲素蛋白的結晶度相關，結晶度越高，降解速率就越慢。絲素蛋白體內生物降解速率不僅取決于組織的移植位點和力學環境，還與絲素蛋白在制備過程中的特征參數相關。絲素降解是酶解過程，通過細胞代謝產生多肽鏈，其降解速度可以通過絲素的處理模式和后期處理來調節，主要是改變絲素的結晶度。一般情況下，β折疊增多，絲素的降解速率會減慢。研究表明，絲素生物材料的降解速率會直接影響人間充質干細胞的代謝，進而改變骨形成的速率[12]。因此絲素蛋白的加工與材料降解之間的聯系為絲素用于生物醫學材料提供了堅實的基礎。目前，絲素蛋白在組織工程支架中得到了廣泛的應用，并根據組織的不同需要制備出了不同的結構。

2 不同絲素支架的結構

2.1 多孔結構

在3D聚合物支架中，孔洞結構在組織工程中發揮著關鍵性的作用，它為接種在支架中的細胞形成功能性組織提供了至關重要的框架結構[1]。近年來研究表明，支架的幾何學形貌決定了細胞在支架內構建的組織結構。為了使多孔聚合物支架適用于不同組織的構建，如何改進多孔聚合物支架的構建及制備已經成為研究的熱點。且孔洞的形狀、大小、孔壁的厚度和粗糙度等對種植在支架中的細胞的活性、增殖及分化等均會產生不同的影響。下面以骨組織的體外構建為例，列舉了幾種不同的結構對組織構建的影響。

Correia等[13]分別以水和六氟異丙醇為溶劑制備了片層孔和球形孔的多孔支架，結果表明，球形孔（孔徑400～600 μm）更利于骨組織的生長分化。然而Oliveira等[14]卻發現，將凍干法制備出的片層孔結構用于骨組織體外結構時，片層孔結構對細胞產生了接觸導向的作用，誘使新形成的膠原沿著片層孔的走向分泌。因此不同的孔洞形狀在組織工程中也有不同的應用。

Wang等[15]分別利用凍干法和鹽析法制備的多孔絲素蛋白支架用于體外軟骨組織構建。結果表明，鹽析法制備出的絲素支架具有較大的孔徑、較高的孔隙率和結晶度，利于細胞在支架內均勻分布，并提高了細胞的增殖和分化能力。然而為了更準確地模擬天然軟骨的不同孔徑結構，Hofmann等[16]利用鹽析法制備出大孔（孔徑400～500 μm）與小孔（孔徑112～224 μm）共存的絲素支架用于軟骨組織構建，其中大孔結構和小孔結構分別分布在支架的兩端。通過比較細胞在大孔結構、小孔結構及大小孔結構上的增殖、活性及分化能力等，可以看出大小孔共存的結構在動態培養下更利于細胞的增殖分化，且細胞活性更高。因此準確地模擬天然組織的結構對成功構建組織有較大的影響。

Makaya等[17]分別采用蔗糖及氯化鈉為致孔劑，相應地以六氟異丙醇及水為溶劑制備了兩種多孔絲素支架。其中蔗糖/六氟異丙醇支架內部孔洞為圓形，孔壁較薄且均一；而氯化鈉/水制備出的支架孔洞為方形，孔壁較厚、表面粗糙且是微孔狀的。將軟骨細胞種植在兩種支架中發現形成的軟骨組織在蔗糖/六氟異丙醇支架中分布較為均勻，這是因為支架的孔壁較薄，在軟骨形成過程中孔壁發生收縮利于軟骨組織沉降物的分散。

綜上所述，不同的結構對于組織構建會產生不同的影響，準確模擬天然組織的結構是成功構建組織的關鍵因素之一。除了上述列舉的方法與應用外，作者實驗室采用熱致相分離法制備了絲素支架，通過調節制備條件可以得到不同結構特征的絲素支架，如圖1所示，其中圖1(a)顯示支架表面所形成的孔洞為條形孔，圖1(b)中顯示支架表面形成的孔洞結構為圓形孔。

2.2 纖維結構

圖1 絲素蛋白支架表面孔洞結構的電鏡圖

天然細胞外基質（extracellular matrix，ECM）主要由兩類大分子構成：①多糖類，被稱為黏多糖（GAGs），通常與蛋白共價連接形成蛋白聚糖；②纖維蛋白，如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白及層粘連蛋白，它們同時具有結構功能和黏附功能[18]。蛋白聚糖分子形成高度水合凝膠，組裝的纖維蛋白被嵌入其中，并與細胞通過力學的和化學的信號相互作用。因此，基于天然 ECM 結構特征，納米技術尤其是納米纖維技術，因其適于構建人工基質已經成為這個領域的重要方向。一般制備納米纖維結構的方法有自組裝[19-20]、相分離[21]和電紡技術[22]等。除了傳統的納米纖維結構外，為了滿足不同組織對支架的不同力學要求，近年來又新興了很多納米纖維結構。

Santos等[23]將淀粉與聚已內酯（質量比 30∶70）制備成納米纖維與微米纖維共混的支架，其中納米纖維利于細胞的黏附和增殖，而微米纖維則對支架提供力學支撐。隨后 Sahoo等[24]將聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米纖維涂層在絲素微米纖維編織支架上形成共混支架，這種復合方式不僅使支架的力學性能得到了提高，而且為細胞在表面上的增殖與黏附提供了更大的接觸面，增加細胞支架上下表面的增殖率。但是，微米纖維的加入是否會影響細胞在支架上的生長呢？Bondar等[25]為人們解除了這方面的擔憂，他們通過對比內皮細胞在絲素納米纖維與微米纖維支架上的生長情況得出，內皮細胞在納米纖維和在微米纖維上的細胞間接觸分子的表達或細胞增殖率上并無顯著性差異。

除了將微米纖維結構加入到納米纖維結構提高支架的力學性能外，細胞外基質中的環形結構對組織的生物力學性能也起著關鍵性的作用。Bhattacharjee等[26]將絲素與殼聚糖交聯制備了環形的纖維支架用于椎肩盤組織的再生。殼聚糖的加入提高了支架的硬度，環形的層狀纖維誘導細胞延著纖維的方向黏附、生長及分化，同時提高了支架的力學性能。當然，多股納米纖維以不同的方式組合同樣可以提高支架的力學性能。Li等[27]將兩股絲素纖維絲（共3456根）相互纏繞形成的纖維簇（即wired結構）用于前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）的體外構建，通過對比另外兩種結構（辮子形和直線形）得出， wired結構的支架力學性能明顯高于其它兩種，可媲美天然 ACL的力學性能。

2.3 纖維-多孔結構

纖維結構具有較大的比表面積，利于細胞的黏附和增殖，但辮子狀、直線狀及wired形狀的纖維結構等由于其相對致密的結構而不利于營養物質的運輸，同時降低了細胞的接種量以及細胞在支架內部的滲透和細胞外基質的分泌。因此多孔結構在纖維支架里發揮著重要作用。Liu等[28]將編織的絲素支架與多孔的絲素海綿結合用于韌帶組織工程。這種結構一方面利于支架的傳質，另一方面用多孔的絲素海綿代替傳統構建韌帶組織時所加入的凝膠，便于細胞在支架內的滲透，而且克服了細胞-凝膠在體內動態環境中被排斥的弊端。

對于多孔支架來說，加入纖維可以提高細胞的黏附及分化能力，同時也提高了支架的力學性能[25]。Stoppato等[29]將氯化鈉與絲素纖維混合利用鹽析法制備混有絲素纖維的聚乳酸多孔支架，結果表明，加入絲素纖維后，支架的性能得到了提高，同時增加了支架對內皮細胞的體外供養能力以及體內血管化的能力。

圖2 不同放大倍數下支架表面的電鏡圖

由此可見，纖維-多孔結構支架中的纖維結構可以提高細胞在支架上的黏附和增殖能力，而多孔結構則利于細胞在支架上向內生長，促進營養物質及代謝產物在支架內的運輸及傳遞，擁有了多孔結構和纖維結構在組織構建中的雙重優勢。作者實驗室利用熱致相分離法制備了多孔的絲素纖維支架，如圖2所示，支架表面形成了多孔的納米纖維與微米纖維共混的結構，其中納米纖維可以促進細胞在支架表面的黏附與增殖，而微米纖維除了具有促進細胞在支架表面的黏附與增殖外，還對支架的結構起到支撐的作用。

2.4 水凝膠結構

絲素水凝膠是絲素蛋白水溶液在酸、脫水劑、離子、超聲處理或者凍干的作用下由溶膠轉變成凝膠而得。蛋白濃度的增加，溫度的升高以及Ca2+的加入都可以加速溶膠-凝膠的轉變。絲素水凝膠可用于注射或非注射傳遞系統，且研究表明絲素水凝膠的力學性能適于組織工程相應組織的體外構建。

Fini等[30]將成骨細胞包載在絲素水凝膠內體外培養一段時間后，用于兔子遠端股骨極量缺損的修復治療。研究結果表明，在絲素水凝膠中，TGF-β1的表達顯著增加，新形成骨中骨小梁的體積、厚度和面積等都有顯著提高，且新形成的骨結構與正常骨相似，說明絲素水凝膠加速了修復的過程。Diab等[31]以鼠股骨節段極量缺損為模型，將載有骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）的絲素水凝膠填充在納米纖維聚已內酯（polycaprolactone，PCL）網眼管中用于大骨缺損的治療，研究結果表明，絲素水凝膠是 BMP-2的優良載體，而且在實驗結束時被完全降解，避免了支架在構建組織時所產生的免疫排斥等不良反應。

除了傳統的將絲素水凝膠用于單獨包載蛋白或細胞外，Davis等[32]將分離出來的胰島細胞直接用水凝膠包載，同時共載 ECM 蛋白及間充質干細胞用于治療1型糖尿病。結果表明，共載時胰島素的分泌量是對照的3.2倍，同時囊化胰島細胞的功能基因表達量及相關功能蛋白的表達量均增加，同時去分化蛋白表達量降低，這些結果說明了以絲素水凝膠為載體用于胰島的體外移植是有望達到的。此外，作者實驗室利用超聲法制備了絲素水凝膠并將其與微囊化細胞復合，水凝膠結構可以為微囊化細胞提供良好的營養及代謝運輸，微囊可以為細胞提供較大的比表面積，便于細胞的黏附和增殖。圖 3所示便為絲素水凝膠與微囊化細胞的復合體。

水凝膠由于它的高含水量以及與天然組織相似的力學性能而被用于藥物載體及組織工程中。其中可注射水凝膠可以降低凝膠在應用過程中的侵襲性，這反過來還可以降低手術成本及康復成本[33]。可注射水凝膠主要用于一些有空間可供注射的位點，并可通過以下方式制備：物理交聯、化學交聯、酶誘導交聯和離子交聯/自組裝。Zhang等[34]利于超聲誘導制備出可注射絲素水凝膠并包載血管內皮生長因子-165（vascular endothelial growth factor，VEGF165）及BMP-2用于提升上頜竇底，結果表明共載兩種生長因子的水凝膠系統提升上頜竇底較明顯，且組織內有血管生成。

圖3 復合物及復合物內細胞的圖像

2.5 其他結構

除了上述支架結構外，還有一些其他支架結構被用于不同的領域。Wray等[35]將聚四氟乙烯包裹的不銹鋼絲（直徑152～787 μm）線性排列構建絲素支架中孔洞通道，并將這種支架用于大尺寸組織的構建，其中不銹鋼絲產生的孔洞可用于體外血管化的構建。除此這外，在絲素支架表面涂層磷灰石用于骨組織構建[36]、絲素與生物玻璃復合用于骨質疏松的治療等也在一定程度上擴展了絲素蛋白在組織工程中的應用。

3 總結與展望

通過以上對絲素支架的不同結構在組織工程中的應用可知，絲素在組織工程支架中發揮著較大作用。但如何有效地、精準地模仿天然組織以用于體外構建組織，還需要進一步研究天然組織的結構（分子及原子水平），并尋找合適的材料及方法精確地模擬組織結構。有理由相信，隨著組織工程的進一步發展，絲素在組織工程中的應用前景將更為廣闊。

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