多孔半互穿溫敏水凝膠點擊反應固定化酶

丁齊，邢曉東，李麗霞

（南京理工大學化工學院，江蘇 南京 210094）

聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）水凝膠是一種典型的溫敏水凝膠，當外界溫度低于最低臨界溶解溫度（LCST）時，親水基團通過氫鍵與水分子結合，凝膠吸水溶脹。溫度高于LCST時，氫鍵作用減弱，疏水基團間的相互作用加強，凝膠失水收縮[1]。以PNIPAM溫敏型水凝膠固載酶，可以利用其可逆的相轉變過程，在其LCST附近升降溫度，凝膠收縮溶脹吸入或吐出底物使反應進行或中斷，起到一個“開關”的作用，而且溫度高時凝膠收縮疏水，有利于保護酶不會高溫下失活；同樣的原理，還可以利用溫敏凝膠的這種特性來固定化酶，溫度低時，凝膠溶脹將酶溶液吸入內部，進行固定化反應，溫度高時，凝膠收縮將沒有反應的溶液排出。半互穿聚合物網絡（semi-IPN）技術可以改善水凝膠的性能，在 semi-IPN水凝膠中兩種組分間沒有化學結合，各組分具有相對獨立性，這種結構可以提高每個分子鏈的相容性，增加網絡密度，增大相互間結合力[2]。Alves等[3]以N-異丙基丙烯酰胺、海藻酸鈣制備了 pH/溫度敏感的半互穿水凝膠，并分別研究了其pH值、溫度響應性。Guo等[4]以羧甲基殼聚糖和聚（N-異丙基丙烯酰胺）制備了半互穿網絡的水凝膠聚合物，并研究了該聚合物的藥物釋放性能。

巰基是蛋白質氨基酸殘基中最活潑的反應性基團[5]，其與馬來酰亞胺的邁克爾加成反應是經典的點擊化學反應。該反應在三乙胺催化下具有反應選擇性、活性高及反應條件溫和的特點[6-7]。已有的文獻，大多是以戊二醛為交聯劑進行酶的固定化的，很少有研究者利用點擊反應進行酶的固定化研究。本工作以甲基丙烯酸-β-羥乙酯（HEMA）和N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）為原料制備了溫敏型的多孔半互穿水凝膠，然后引入馬來酰亞胺基團修飾，得到新型固定化酶載體：水凝膠Ⅰ和Ⅱ，研究了其溶脹性能，然后利用馬來酰亞胺與巰基的點擊反應進行酶的固定化[8]，并全面考察了固定化酶的性能。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）（≥98%），偶氮二異丁腈（AIBN）（99%），順丁烯二酸酐（馬來酸酐，AR，99.5%），阿拉丁試劑有限公司；N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS，≥98%），天津市化學試劑研究所，乙醇重結晶；聚乙二醇2000（PEG2000，CP），西隴化工有限公司；2-hydroxyethyl methacrylate（HEMA，97%），ACROS ORGANICS；脂肪酶、糖化酶，國藥集團化學試劑有限公司。

JSM-6380LV型掃描電鏡，日本 JEOL公司；Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 水凝膠酶固定化載體的制備及表征

1.2.1 水凝膠及凝膠固定化載體的制備

（1）線型聚合物 PHEMA和PAEMA 的制備

PHEMA：將5 mg引發劑AIBN以及單體HEMA 0.9 g溶于4 mL DMSO中，通氮氣，60 ℃反應10 h。PAEMA： PHEMA 加入適量乙二胺，117 ℃回流10 h，除去未反應的乙二胺，得到產物。反應式如式（1）。

（2）多孔半互穿水凝膠的制備

制孔劑PEG2000 100 mg、單體NIPAM 150 mg、交聯劑Bis 4 mg、引發劑AIBN 3 mg以及PHEMA或PAEMA 75 mg于DMSO 0.6 mL中溶解，通氮氣，60 ℃反應6 h，得到半互穿凝膠C或B，將凝膠于蒸餾水中浸泡14天（每天換水）。水凝膠C于乙二胺中117 ℃回流10 h，反應結束后沸水洗滌，得到水凝膠A。反應式如式（2）、式（3）。

（3）水凝膠的馬來酰亞胺修飾

10 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）為溶劑，分別加入水凝膠 A、B，通氮氣，邊攪拌邊滴加馬來酸酐（0.5 g），滴加完畢后繼續攪拌1 h。然后加入5 mL三乙胺，153 ℃回流4 h，反應結束后用水洗滌凝膠多次，分別得到水凝膠Ⅰ和Ⅱ。反應式如式（4）。

1.2.2 水凝膠Ⅰ和Ⅱ的表征及性能測試

真空干燥好的水凝膠A、B、C、Ⅰ、Ⅱ研成粉末，采用衰減全反射（ATR）法測定其紅外光譜。

室溫下達到溶脹平衡的水凝膠Ⅰ和Ⅱ切片，快速冷凍后冷凍干燥48 h做掃描電鏡表征。多孔半互穿水凝膠具有多孔結構，采用冷凍干燥可以保持水凝膠的結構在干燥過程中不被破壞。

將水凝膠Ⅰ和Ⅱ在 20～50 ℃蒸餾水中浸泡，待其達到溶脹平衡，用潤濕的濾紙拭干水凝膠表面的水分，稱重。水凝膠的溶脹比 SR定義為：SR=(ms?md)/md。式中 ms為達到某一溫度溶脹平衡狀態時的水凝膠的質量；md為真空干燥至恒重時凝膠的質量。

將室溫下達到溶脹平衡的水凝膠Ⅰ和Ⅱ快速轉移至 50 ℃的蒸餾水中，每隔一定時間取出水凝膠稱取水凝膠的質量mt，直至其質量不變為止。水凝膠保水率 WR 定義為：WR=(mt?md)/ mr×100% 。式中mr為室溫下達到溶脹平衡時水凝膠中水的質量。作保水率與時間的關系曲線，即得水凝膠在 50 ℃的去溶脹動力學曲線。

將真空干燥至恒重的水凝膠Ⅰ和Ⅱ浸泡在室溫下的蒸餾水中，每隔一定時間，取出水凝膠稱重，直至其質量不變。凝膠吸水率 WU定義為：WU=(mt?md)/mr×100%。作吸水率與時間的關系曲線，即得水凝膠在室溫下的再溶脹動力學曲線。

1.3 固定化酶的制備及性能測定

1.3.1 固定化酶的制備

根據Agnieszka等[9]提出的方法，利用多孔半互穿溫敏水凝膠的溫敏性能，高溫時凝膠收縮，將其加入到酶溶液中，凝膠開始吸收酶溶液發生溶脹，酶分子在凝膠內部與凝膠發生交聯反應，制得固定化酶。得到的固定化脂肪酶于0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH值 7.0）4 ℃保存，固定化糖化酶于0.1mol/L的乙酸鹽緩沖液（pH值4.5）4 ℃保存，備用。反應式如式（5）。

在本實驗中，將采用以水凝膠A和B為載體，2.5%戊二醛溶液為交聯劑的固定化酶作為對比（本研究條件下，戊二醛濃度為2.5%時得到的固定化酶活性、穩定性等相對最佳）。

1.3.2 固定化酶性能測定

酶的固載量測定采用 BCA蛋白試劑盒法。固載量=(c初?c余)v/m干凝膠，式中，c初為固定化之前初始酶液的蛋白濃度，mg/mL；c余為固定化后酶余液的蛋白濃度，mg/mL；v為固定酶時所用酶溶液的體積，mL；m干凝膠為干燥的凝膠載體的質量，g。

在一定條件下，酶催化反應進行每分鐘釋放出1 μmol產物所需酶/固定化酶的量為一個活力單位（U）：U=cv/tm。式中，U為酶活力，U/g或U/mL；c為產物的濃度，μmol/mL；v為產物溶液的體積，mL；t為反應時間，min；m為消耗的酶的質量，g；糖化酶為體積，mL。脂肪酶的活力測定采用對硝基苯酚棕櫚酸酯（Pnpp）法；糖化酶的活力測定采用葡萄糖氧化酶法（GOD）法。

活力回收率=Us/U0×100%。其中，Us為固定化酶的活性，U/g或 U/mL；U0固定化之前游離酶的活性，U/g或U/mL。

連續進行 10次催化反應后固定化酶的活性與剛剛固定化之后酶的活性之比為固定化酶的操作穩定性，設剛固定化完后固定化酶的活力為 100%；65 ℃下保存16 h后固定化酶的活性與剛固定化完后酶活力比值即為固定化酶的熱穩定性；4 ℃下保存 20天后固定化酶活力與剛固定后固定化酶的活力比值即為固定化酶的貯存穩定性。

2 結果與討論

2.1 溫敏型大孔半互穿水凝膠的表征與性能

2.1.1 紅外光譜分析

圖1 水凝膠紅外光譜圖

圖1是水凝膠A、B和C的紅外譜圖。

圖1中，3290～3430 cm?1為PNIPAM 中N—H以及PHEMA中O—H的伸縮振動吸收峰；3078 cm－1為N—H 面內彎曲振動倍頻帶； 2874 cm－1、2931 cm－1、2966 cm－1處由甲基亞甲基以及聚合物主鏈上的C—H伸縮振動產生；1650 cm－1由酰胺上羰基伸縮振動產生，即酰胺Ⅰ帶，1538 cm－1由酰胺上N—H面內彎曲振動及C—N伸縮振動的組合吸收產生的，即酰胺Ⅱ帶，在1385 cm?1、1365 cm?1處為異丙基上的雙甲基由于對稱變形振動耦合分裂成的雙峰。不同的是：水凝膠C中，1725 cm?1處為PHEMA中酯的羰基伸縮振動吸收峰；1135 cm－1，1080 cm?1處為C—C，C—O單鍵伸縮振動吸收峰；1047 cm?1處是PHEMA中羥基的C—O伸縮振動吸收峰。水凝膠 A 中，1725 cm?1處的吸收峰減弱，1047cm?1處的吸收峰消失，這都說明了乙二胺與酯基發生反應，乙二胺修飾成功。而水凝膠B中，1725 cm－1處吸收峰相對于凝膠 A減弱的更多一些，1047cm－1處的吸收峰也消失，說明了該凝膠的制備成功，而且其α-NH2的含量比A凝膠多。

圖2 多孔半互穿水凝膠載體紅外光譜圖

圖2為馬來酰亞胺化水凝膠的紅外光譜圖，理論上 1775 cm?1、1711 cm－1和 1143 cm－1為酰亞胺基團特征吸收峰，1604 cm－1為碳碳雙鍵特征吸收峰[10]。但是本實驗紅外光譜圖中未觀察到明顯的特征吸收峰，原因可能是水凝膠的酰胺基紅外吸收峰較大，相對少量的馬來酰亞胺基團特征峰被覆蓋，以至于觀察不到。

2.1.2 掃描電鏡

將凝膠制備成多孔結構，有利于凝膠溶脹/退溶脹速率的增加，底物的進出和酶的固定化。本研究以PEG2000為致孔劑制備多孔水凝膠，馬來酰亞胺基團修飾后水凝膠載體Ⅰ和Ⅱ的掃描電鏡照片如圖3所示。

圖3 多孔半互穿水凝膠載體Ⅰ、Ⅱ掃描電鏡圖

從圖3可以看出兩種水凝膠載體均含有相互貫通的多孔結構，孔洞大小及分布比較均勻。水凝膠Ⅰ孔徑較大，平均為30 μm左右；水凝膠Ⅱ的孔徑平均為10 μm，與水凝膠Ⅱ孔徑相比較小。大量的孔洞增加了水凝膠與外界的接觸面積。

2.1.3 水凝膠的溶脹率

溶脹率（SR）是評價水凝膠性質的一個重要參數[11]。本工作研究了溫度對溶脹率的影響。

由圖4可知，20 ℃時水凝膠Ⅰ的SR可達到22，而水凝膠Ⅱ的SR僅為14。以交聯劑用量來表征交聯度[12]，兩種水凝膠 SR相對于其他文獻較小的原因是本文所制備的兩種水凝膠交聯劑用量為2.6%，為了保證水凝膠有一定的強度所以交聯度比較大，從而導致其溶脹比較小。水凝膠B的胺化程度高于A，從而導致Ⅱ的馬來酰化程度也稍高于Ⅰ，而親水性小于Ⅰ。隨著溫度升高， 兩種水凝膠開始收縮脫水，SR越來越小。33 ℃以后，水凝膠Ⅰ的 SR下降的很快，37 ℃左右開始趨于平衡狀態；水凝膠Ⅱ的SR下降的相對比較平穩，也是在37 ℃左右開始達到平衡狀態。從圖4中可以看出，兩種水凝膠的 LCST均在33～36 ℃之間，與聚（N-異丙基丙烯酰胺）溫敏凝膠的 LCST[13]相差不大，說明半互穿結構對水凝膠的溫敏性沒有產生影響。

2.1.4 水凝膠的去溶脹動力學

圖4 水凝膠不同溫度平衡時的溶脹比曲線

如圖5所示，水凝膠Ⅰ在最初的10 min內快速失去網絡結構中約90%的水分，保水率快速下降，約20 min后達到穩定狀態，此時失去約 93%的水；而水凝膠Ⅱ失水更快一些，在 10 min 內失水約95%，約20 min開始趨于穩定狀態。當水凝膠處在較高溫度（LCST以上）時開始收縮，表面區域的相互作用首先被破壞，并迅速釋放結合的水分子。可以看出兩種水凝膠對溫度響應均很敏感，在短時間內能夠對外界溫度的變化作出較快的響應，這有利于固定化酶催化反應的控制。可能是由于水凝膠Ⅱ含有的孔洞內徑比Ⅰ小，孔洞的量比Ⅰ多，比表面積比較大，水分子能盡快的從凝膠網絡中排出來，所以水凝膠Ⅱ的溫度響應速率比Ⅰ要稍快一些。

圖5 2種水凝膠50 ℃的去溶脹動力學曲線

2.1.5 水凝膠的再溶脹動力學

水凝膠的再溶脹動力學曲線見圖 6。與去溶脹相比，水凝膠的再溶脹速率要慢得多。這是由于水凝膠去溶脹時，處于溶脹狀態，高分子鏈的自由度較大；而當干凝膠進行再溶脹時，高分子鏈間距離較小，疏水作用較強，水分子需要首先破壞這種疏水作用才能使凝膠吸水再溶脹，因而其再溶脹速率要慢得多[12]。水凝膠Ⅰ和Ⅱ在前50 min內吸水量基本呈線性上升，吸水率大致相當；從70 min開始，兩種水凝膠吸水率有了變化，水凝膠Ⅰ的吸水率稍大于Ⅱ，并以這種趨勢平緩增長，250 min時其吸水率達到92%，此后吸水率趨于穩定。水凝膠Ⅱ的再溶脹曲線走勢與Ⅰ大致相同，在250 min時開始趨于穩定狀態，但此時水凝膠Ⅱ的吸水率約為88%，稍小于水凝膠Ⅰ。

2.2 水凝膠載體巰基固定化酶性能

圖6 水凝膠25 ℃的再溶脹動力學曲線

表2為固定化酶的固載量、活性、活力回收率、穩定性等性能參數。

由表2可知，凝膠Ⅱ固定化酶的固載量為25.50 mg/g，大于凝膠Ⅰ固定化酶的14.60 mg/g。分析可能原因是由于NIPAM/PAEMA水凝膠中α-NH2含量比較高，引入的馬來酰亞胺基團也NIPAM/PHEMA凝膠要多，所以通過巰基與馬來酰亞胺反應的酶的量也多，因此凝膠Ⅱ固定化酶的固載量相對來說比較大。凝膠Ⅱ固定化酶活力為0.82 U/g，活力回收率可達到 6.03%，比較可觀，從穩定性來看，其操作穩定性可達到接近 90%，而熱穩定性也可達到80%以上，儲存穩定性達90%以上，回收重復利用的價值比較大；凝膠Ⅰ固定化酶的酶活力為0.59 U/g，活力回收率為4.32%，小于凝膠Ⅱ固定化酶，其操作穩定性和熱穩定性也不及凝膠Ⅱ固定化酶，但儲存穩定性相近。綜合來看Ⅰ和Ⅱ固定化酶的活性以及各項穩定性均比相應的A和B要高，可能原因：戊二醛分子之間發生相互的交聯反應，影響了固定化的效率；一個酶分子可能通過多點與戊二醛交聯，使得酶分子被禁錮在中間，活性大大降低；戊二醛還可以與酶分子上的其他活性官能團發生反應，從而降低酶的活性或使酶失活[14-15]。而馬來酰亞胺與巰基的點擊反應選擇性高，不會與其他活性基團發生反應，而且其反應條件比較溫和，不會影響酶的活性，所以得到的固定化酶活性比較大。

表2 固定化酶性能

糖化酶的固載量小于脂肪酶，但由于其游離酶本身活性比較大（需要稀釋一定倍數以便測定其活性），所以雖然糖化酶的固載量小，是其活性卻較大。與固定化脂肪酶相似，凝膠Ⅱ固定糖化酶的固載量為0.82 mg/g，約是凝膠Ⅰ固定化酶的2倍，其酶活力最大可達12.04 U/mL，此時活力回收率為3.40%，其操作穩定性、熱穩定性均在85%以上，具有很高的回收利用價值。凝膠Ⅰ固定化酶的酶活力為10.05 U/mL，活力回收率為2.84%，略小于凝膠Ⅱ固定化酶，但其操作穩定性與其相當，熱穩定性也在70%以上，穩定性也比較好。與脂肪酶不同的是，戊二醛固定化糖化酶的固載量雖大，但是活性卻不及固載量小的巰基固定化，可能是戊二醛在糖化酶的固定化中，多點固定占據了主要地位，所以雖然固載量大，但酶的活性卻降低了。

與常用的戊二醛法固定化酶相比，通過載體中馬來酰亞胺與巰基的點擊化學反應進行酶的固定化，在相同實驗條件下，固定化酶的活性、活力回收率均成倍提高，其中凝膠Ⅱ固定化脂肪酶的活力達0.82 U/mL，活力回收率達6.03%，均為戊二醛固定化酶的5倍左右，酶的穩定性也有較大提高。

3 結 論

制備了兩種新型溫敏半互穿水凝膠載體Ⅰ和Ⅱ，這兩種水凝膠均含有相互貫穿的多孔結構，具有大的比表面積，對溫度變化能快速響應，是一種比較理想的固定化酶的載體。利用載體上的馬來酰亞胺基團與酶分子上巰基的點擊反應進行酶的固定化，具有反應選擇性高，反應條件溫和，方法易于操作的優點，而戊二醛固定化會發生多點結合、分子內或分子間結合、與其他活性官能團結合等情況使得固定化酶的活性降低。點擊反應得到的固定化酶活性最高可達6.03%，是戊二醛固定化酶的5倍，且其穩定性較好，具有很大的回收利用價值。

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