適用于鐮刀菌基因敲除和熒光融合蛋白表達的高效通用載體的構建

王曉亮， 張 昊， 潘 逸， 許景升， 徐 進， 馮 潔

（中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

絲狀真菌是一類產生繁茂菌絲體不產生子實體的真菌，廣泛分布于自然界，在工業、農業、醫藥以及基礎生物學研究中具有重要作用［1－2]。禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearumSchwabe）等植物病原真菌是絲狀真菌的重要組成部分，由禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病 （Fusariumhead blight，FHB）是一種世界范圍內的重要病害［3]，近年來在我國發生尤為嚴重。該病害的流行除了引起小麥產量損失外，禾谷鐮刀菌還能產生多種毒素，造成食品安全上的巨大隱患［4－6]。

禾谷鐮刀菌的全基因組測序已于2002年完成，測序菌株為歐洲和北美發現的野生型菌株PH－1，測序結果包括基因組序列、遺傳圖譜和表達序列標簽等［7－9]。在此基礎上，采用比較基因組學、生物信息學方法對禾谷鐮刀菌生長發育、致病和毒素合成等分子機制的研究成為熱點并取得了較大的進展，禾谷鐮刀菌等植物病原絲狀真菌基因組學的時代已經到來［10]。Wang等系統地對禾谷鐮刀菌所有116個蛋白激酶基因進行了功能鑒定，獲得了96個基因的突變體，得到了大量表型數據，為進一步明確其參與代謝調控網絡奠定了基礎［11]。Jiang等鑒定了HOG途徑中多個關鍵基因的功能，明確了其信號轉導機制［12－13]。Kimura等闡明了禾谷鐮刀菌中單端孢霉烯族毒素合成的分子調控機制［14]。最近，Zhao等利用RNA－Seq技術對于禾谷鐮刀菌的基因組的注釋進行了修訂，修改了655個錯誤的基因注釋，鑒定了2 459個轉錄活躍區，確定了7 666個基因的5′UTR和3′UTR［15]。與此同時，利用反向遺傳學方法，直接從基因入手，通過基因敲除和回復、基因沉默、基因過表達和對相關蛋白進行定位等來研究基因功能的文章也已經十分普遍。王光輝等研究得出小麥赤霉菌中的精氨酸甲基轉移酶基因對于赤霉菌菌絲的正常生長和致病性都有重要的作用［16]。Min等研究得出，在禾谷鐮刀菌中敲除過氧化物酶體基因PEX5、PEX6和PEX7，影響了碳源營養的利用和致病性［17]。但是，目前對于基因敲除和回復、過表達外源蛋白或熒光融合蛋白，基本上每個基因還需各自獨立構建載體，缺少通用的載體，耗費的時間精力非常多［1]。在構建敲除載體的時候，兩條同源重組片段需要連接在載體抗性基因的兩側，這樣就需要使用4種不同的酶切位點、2次成功的轉化來保證重組片段的方向性和正確性（圖1）。近些年來，出現了很多依靠不同的限制性內切酶消化出特定酶切位點，再將常規PCR獲得同源重組片段插入到這些位點上的高通量的技術，包括了Xi克隆法（Xi－cloning）、連 接 酶 克 隆 法 （LIC－PCR）、重 組 克 隆 法（recombinational cloning）以及USER酶克隆技術（USER friendly cloning techniques）［18－21]。

USER（uracil－specific excision reagent）酶克隆技術，可以在不使用酶切位點和DNA連接酶的條件下直接將PCR產物克隆到載體。USER酶是一種特異性切割尿嘧啶的混合酶，包含尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）和核酸內切酶Ⅷ。其中，UDG催化尿嘧啶堿基的切除，形成一個脫嘧啶位點，但同時保持了磷酸二酯鍵骨架的完整性。核酸內切酶Ⅷ的裂解酶活性則分別在脫堿基位點的3′端 和5′端裂解磷酸二酯鍵骨架，釋放無堿基的脫氧核糖。此方法需在PCR引物5′端加入一段較長的（8～10bp）包含有脫氧尿嘧啶dU的與載體互補的特異性序列。在USER酶作用下，引物兩側5′端至dU的序列被剪切，形成具有8～10個堿基的3′突出黏性末端，同時在載體上制備與之互補黏性末端，由于黏性末端長度遠長于普通酶切位點，所以不需要DNA連接酶的作用即可完成連接。本研究構建了3個適用于USER酶克隆技術的通用載體，并通過試驗證明這些載體在不需要酶切位點和DNA連接酶的條件下具有很高的連接效率，可用于大規模構建鐮刀菌基因敲除和熒光融合蛋白表達載體，從而進行高通量鐮刀菌基因功能分析。

圖1 基因敲除載體的兩種構建方法Fig.1 Two methods for construction of gene replacement vectors

1 材料與方法

1.1 菌株和DNA

試驗使用的小麥赤霉病菌株為禾谷鐮刀菌國際標準菌株PH－1。將菌株接種在PDA平板上28℃避光培養5d，刮取菌絲于2mL離心管中，液氮速凍，破碎，采用真菌DNA小量提取試劑盒D3390－02（Omega，美國）提取DNA，－20℃保存備用。

1.2 酶和試劑

USERTM酶，PacI酶，Nt.BbvCI酶（New England Biolabs公司，美國），大腸桿菌（E.coli）感受態細胞DH5α（天根生化有限科技公司，北京），寡核苷酸退火緩沖液（碧云天生物技術研究所），PCR篩選陽性克隆使用PCR MIX（東盛集團有限公司，廣州），PRIMERSTAR高保真DNA聚合酶（寶生物公司，大連）所有PCR反應以及溫度孵育過程都在Eppendorf Mastercycler gradient（Eppendorf公司，德國）上進行，引物設計根據Broad研究所提供的數據以及相關的注釋（網址：http：∥www.broad.mit.edu／annotation）并通過Prime Premier 5進行設計，引物合成和后續的測序都由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 載體構建

pKH質粒和pKN質粒由本實驗室保存。pKH質粒是pBluescriptⅡKS質粒為基礎，在EcoRⅤ位點插入了潮霉素抗性片段。pKN質粒是pBluescriptⅡKS質粒為基礎，在XhoⅠ位點插入G418抗性片段。

1.3.1 基因敲除通用載體的構建

合成互補的寡核苷酸序列UBamHI和UEcoRI、DXhoI和DKpnI，來構建抗性基因兩側的USER酶克隆位點（USER cloning sites，UCS）。100μL退火體系：UBamHI（DXhoI）10μmol／L、UEcoRI（DKpnI）10μmol／L、退火緩沖液1×；退火程序：95℃5min，每8s下降0.1℃，降至25℃，4℃保溫，使兩條寡核苷酸序列形成雙鏈互補序列，UBamHI和UEcoRI形成USER酶克隆位點1（UCS1），DXhoI和DKpnI形成USER酶克隆位點2（UCS2）。將UCS1連入pKH載體的BamH I和EcoR I位點，UCS2連入XhoI和KpnI位點，轉化至大腸桿菌獲得單克隆測序驗證，構建載體命名為pKH－KO。

1.3.2 熒光融合蛋白表達通用載體的構建

以pGenGFP載體為模版，用PRIMERSTAR高保真DNA聚合酶，GFPFHindⅢ和GFPRKpnⅠ為引物擴增獲得大小1 100bp的GFP－Tnos片段，分別連入pKH和pKN兩個載體的KpnⅠ和HindⅢ位點之間，轉化至大腸桿菌，構建載體分別命名為pKHGFPE和pKNGFPE。

1.4 基因敲除與熒光融合蛋白表達通用載體的應用

1.4.1 通用載體的制備

將含有載體pKH－KO、pKHGFPE和pKNGFPE的大腸桿菌接種于含有氨芐的LB培養基，37℃200r／min過夜培養。采用Axygen質粒小提試劑盒（愛思進生物技術公司，杭州）提取質粒。超微量分光光度計NanoVue（GE公司，美國）檢測質粒濃度。采用300μL體系加入70UPacⅠ 后37℃過夜酶切約10μg質粒。第2天，再加入20UPacI和40UNt.BbvCI，37℃溫育1h，取2～3μL酶切產物進行電泳檢測。然后用Axygen DNA純化試劑盒進行純化，得到終濃度約50ng／μL的通用載體，－20℃保存待用。

1.4.2 禾谷鐮刀菌FgPex 5基因敲除載體的構建

根據禾谷鐮刀菌基因組信息設計FgPex 5基因上游序列擴增引物P5UF、P5UR和下游引物P5DF、P5DR，并在引物的5′端分別添加 O1、O2和O3、O4序列：

以基因組為模版采用東盛taqmix擴增FgPex 5基因的上下游片段P5U和P5D，電泳檢測PCR產物濃度。使用25μL體系進行酶切連接，體系包含：

反應條件：37℃溫浴20min，25℃溫浴20min。反應產物轉化大腸桿菌，挑取單克隆測序驗證。

1.4.3 禾谷鐮刀菌FgPex 5熒光融合表達載體的構建

根據FgPex5基因序列信息設計引物P5PF、P5GR，擴增包含上游啟動子與ORF的序列（不含終止子）P5PG，并在引物的5′端分別添加1.4.2中O3和O4序列。

以基因組為模版，采用PfuTurbo?Cx Hot－start DNA Polymerase（Agilent，600410）擴增包含啟動子的FgPex 5基因序列P5PG。使用25μL體系進行酶切連接，體系包含：

反應條件：37℃溫浴20min，25℃溫浴20min。反應產物轉化大腸桿菌，挑取單克隆測序驗證。

1.4.4 原生質體的轉化

參考Desmond的方法［22]制備原生質體，并將構建好的載體用KpnⅠ線性化后進行原生質體轉化，獲得的轉化子使用相應的潮霉素B或G418進行抗性篩選。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers for experiments

2 結果與分析

2.1 基因敲除與熒光融合表達載體的構建與應用

構建了基因敲除通用載體pKH－KO（圖2a）和熒光融合蛋白表達通用載體pKHGFPE（圖2b）和pKNGFPE（圖2c）。

本方法通過特定的酶將載體上的USER酶特異位點和兩條PCR重組片段產物消化出互補的黏性末端，通過一次連接反應就能將兩條同源重組片段連接到抗性基因的兩側。在目的基因的兩條同源重組片段擴增引物的5′端加上含有尿嘧啶脫氧核苷酸的9個堿基（圖3a），這樣PCR獲得的同源重組片段在USER酶的作用下就會被消化出特定黏性末端（圖3b）。使用PacⅠ和Nt.BbvCI兩種酶消化含有UCS序列的通用載體，使其出現與同源重組片段互補的黏性末端（圖3c）。由于互補序列長達9個堿基，上述兩個消化產物可以在沒有DNA連接酶的條件下直接完成連接反應（圖3d）。連接產物可以直接進行下一步試驗（圖3e）。熒光融合表達載體的構建原理與之相同。

圖2 載體的示意圖Fig.2 The constructed USER vector

圖3 USER酶一步法構建基因敲除載體示意圖Fig.3 The USER enzyme strategy for single step construction of gene replacement vectors

2.2 FgPex5基因敲除與GFP融合表達轉化子的鑒定

使用基因敲除通用載體pKH－KO在禾谷鐮刀菌野生型菌株PH－1中進行FgPex 5基因敲除。對于獲得的轉化子采用PCR鑒定的方法進行篩選，泳道1、2、3、4為野生型菌株PH－1電泳結果，5、6、7、8為FgPex 5基因缺失突變體菌株電泳結果。用3對引物檢測轉化子其位置如圖4所示，3對引物各自作用如下：

1）引物5nF和5nR是用來檢測目的基因是否被敲除（泳道2、6）；2）引物H852和H850是用來檢測hph基因的存在（泳道1、5）；3）引物5wF和H852是用來檢測上游的同源重組的發生（泳道3、7）；4）引物H850和5wR是用來檢測下游的同源重組的發生（泳道4、8）。只有當如圖同源重組發生時，目的基因才會被hph基因替換掉。

使用熒光融合蛋白表達通用載體pKNGFPE導入到菌株中，將孢子和萌發的菌絲在熒光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2，德國）下觀察并拍照，GFP熒光的激發波長在488nm，結果如圖5所示。

圖4 PCR驗證檢測策略及結果Fig.4 The PCR analysis of mutants

圖5 熒光定位蛋白信號圖Fig.5Subcellular localization of GFP fusion protein in the mutants

3 結論與討論

對于真菌基因組測序結果的初步注釋已經預測到了大量沒有相關同源蛋白的假設蛋白［23]。僅就禾谷鐮刀菌PH－1而論，在13 938個假設基因里就有8 091個基因（占58%）是“保守假設蛋白”或者“假設蛋白”一類［24]。面對如此多的假設基因和假設蛋白，我們就需要一個十分高效的基因敲除策略來研究各個基因對于致病性和次級代謝物方面的影響。

采用傳統方法構建基因敲除載體，需要至少兩次酶切、連接、轉化分別連接兩個同源重組片段，而本方法將酶切與連接步驟合并，并且僅需一步可以同時連接上兩個片段（圖1），極大地簡化了工作、提高了效率。影響載體構建工作的另一個限制因素是酶切位點的選擇，克隆片段中的酶切位點直接影響到載體的構建，一般的載體可以提供多個位點進行選擇，但面對全基因組眾多基因來說，仍然是遠遠不夠的，特別是熒光融合蛋白表達載體構建中選擇酶切位點的同時還要考慮兩個基因之間linker序列的堿基數目，這就更加限制了酶切位點的選擇。而本方法的另一個優勢就在于采用自身構建的9bp互補序列進行連接，完全省去了酶切位點選擇的步驟，這為載體的構建從設計上減輕了很大的工作量。同時，相對于普通酶切位點2～3個堿基黏性末端的連接，本方法中長達9bp的黏性末端在不用DNA連接酶的情況下使連接效率得到了很大的提高。近年來split－marker方法［25]構建敲除載體在鐮刀菌的基因功能分析中得到了比較廣泛的應用［11，26]，與傳統方法相比，步驟簡單，省時省力。但在實際操作過程中發現，不同基因重疊PCR條件差異較大，經常出現重疊失敗或者重疊擴增效率低、產物量少，不足以進行下一步轉化的情況，摸索最佳條件往往花費很長時間。而本方法所采用的全部是最基礎的分子生物學實驗技術，成功率高，更易于上手操作。

使用本文的方法進行載體構建由于擴增引物中含有dU，所以需要注意DNA聚合酶的選擇。來源于真細菌的Taq酶可以擴增dU，對于片段較短、保真性要求不高的基因敲除載體構建可以選用Taq酶。而構建熒光融合表達載體則需要擴增包含啟動子的整個基因，片段較長并且要求不能有堿基錯誤，這就需要用高保真DNA聚合酶。但一般來源于古細菌的高保真DNA聚合酶如Vent、Pfu等均無法正常擴增dU［27]。因此，本研究選用了目前唯一能夠擴增dU的高保真DNA聚合酶PfuTurbo?Cx Hotstart DNA Polymerase（Agilent，600410）進行擴增，取得了很好的效果。

本實驗室通過使用USER酶一步載體構建法構建了禾谷鐮刀菌十幾個過氧化物酶體基因（如Fg－Pex5基因）的敲除載體與綠色熒光蛋白融合表達載體，進行了原生質體的轉化，獲得了大量的基因敲除轉化子，在轉化效率上與傳統載體構建方法相比沒有明顯差異。采用這種方法構建目的載體十分適合高通量的基因敲除與熒光融合表達試驗［27]。這種方法對于在實驗室條件下進行鐮刀菌基因敲除和蛋白定位等基因功能的研究有著很大的應用前景。

［1]李海嬌，盧建平，劉小紅，等.適用于稻瘟病菌基因敲除、過表達和熒光融合蛋白表達載體的構建和使用［J].農業生物技術學報，2012，20（1）：94－104.

［2]陳獻忠，沈微，樊游，等.后基因組時代的絲狀真菌基因組學與代謝工程［J].遺傳，2011，33（10）：1067－1078.

［3]Watters M K，Randall T A，Margolin B S，et al.Action of repeat－induced point mutation on both strands of a duplex and on tandem duplications of various sizes in Neurospora［J].Genetics，1999，153（2）：705－714.

［4]O’Donnell K，Kistler H C，Tacke B K，et al.Gene genealogies reveal global phylogeographic structure and reproductive isolation among lineages of Fusarium graminearum，the fungus causing wheat scab［J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（14）：7905－7910.

［5]Tanaka T，Hasegawa A，Yamamoto S，et al.Worldwide contamination of cereals by the Fusarium mycotoxins nivalenol，deoxynivalenol，and zearalenone.1.Survey of 19countries［J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1988，36（5）：979－983.

［6]Windels C E.Economic and social impacts of Fusarium head blight：changing farms and rural communities in the Northern Great Plains［J].Phytopathology，2000，90（1）：17－21.

［7]Trail F，Xu J R，Miguel P S，et al.Analysis of expressed sequence tags fromGibberella zeae（anamorph Fusarium graminearum）［J].Fungal Genetics and Biology，2003，38（2）：187－197.

［8]Jurgenson J E，Zeller K A，Leslie J F.Expanded genetic map of Gibberella moniliformis （Fusarium verticillioides）［J].Applied and Environmental Microbiology，2002，68（4）：1972－1979.

［9]Lee J，Jurgenson J E，Leslie J F，et al.Alignment of genetic and physical maps of Gibberella zeae ［J].Applied and Environmental Microbiology，2008，74（8）：2349－2359.

［10]Xu J R，Peng Y L，Dickman M B，et al.The dawn of fungal pathogen genomics［J].Annual Review of Phytopathology，2006，44：337－366.

［11]Wang C，Zhang S，Hou R，et al.Functional analysis of the kinome of the wheat scab fungus Fusarium graminearum［J].PLoS Pathogens，2011，7（12）：e1002460.

［12]Jiang J，Liu X，Yin Y，et al.Involvement of a velvet protein FgVeA in the regulation of asexual development，lipid and secondary metabolisms and virulence in Fusarium graminearum［J].PloS One，2011，6（11）：e28291.

［13]Jiang J H，Yun Y Z，Yang Q Q，et al.A type 2Cprotein phosphatase FgPtc3is involved in cell wall integrity，lipid metabolism，and virulence in Fusarium graminearum［J].PloS One，2011，6（9）：e25311.

［14]Kimura M，Tokai T，Takahashi－Ando N，et al.Molecular and genetic studies of Fusariumtrichothecene biosynthesis：pathways，genes，and evolution［J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2007，71（9）：2105－2123.

［15]Zhao C，Waalwijk C，de Wit P J，et al.RNA－Seq analysis reveals new gene models and alternative splicing in the fungal pathogen Fusarium graminearum ［J].BioMed Central Genomics，2013，14（1）：21.

［16]Wang G H，Wang C F，Hou R，et al.The AMT1arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum ［J].PloS One，2012，7（5）：e38324.

［17]Min K，Son H，Lee J，et al.Peroxisome function is required for virulence and survival of Fusarium graminearum［J].Molecular Plant－Microbe Interactions，2012，25（12）：1617－1627.

［18]Liang X，Teng A，Chen S，et al.Rapid and enzymeless cloning of nucleic acid fragments：United States of America，US 6936470B2［P].2005－08－30.

［19]Aslanidis C，De Jong P J.Ligation－independent cloning of PCR products（LIC－PCR）［J].Nucleic Acids Research，1990，18（20）：6069－6074.

［20]Marsischky G，LaBaer J.Many paths to many clones：a comparative look at high－throughput cloning methods［J].Genome Research，2004，14：2020－2028.

［21]Kodumal S J，Patel K G，Reid R，et al.Total synthesis of long DNA sequences：synthesis of a contiguous 32－kb polyketide synthase gene cluster［J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004，101（44）：15573－15578.

［22]Desmond O J，Manners J M，Stephens A E，et al.The Fusariummycotoxin deoxynivalenol elicits hydrogen peroxide production，programmed cell death and defence responses in wheat［J].Molecular Plant Pathology，2008，9（4）：435－445.

［23]Frandsen R J，Andersson J A，Kristensen M B，et al.Efficient four fragment cloning for the construction of vectors for targeted gene replacement in filamentous fungi［J].BioMed Central Molecular Biology，2008，9：70.

［24]Guldener U，Mannhaupt G，Münsterkütter M，et al.FGDB：a comprehensive fungal genome resource on the plant pathogen Fusarium graminearum［J].Nucleic Acids Research，2006，34：D456－D458.

［25]Catlett N，Lee B N，Yoder O，et al.Split－marker recombination for efficient targeted deletion of fungal genes［J].Fungal Genetics Newsletter，2003，50：9－11.

［26]Son H，Seo Y S，Min K，et al.A phenome－based functional analysis of transcription factors in the cereal head blight fungus，Fusarium graminearum ［J].PLoS Pathogens，2011，7（10）：e1002310.

［27]Greagg M A，Fogg M J，Panayotou G，et al.A read－ahead function in archaeal DNA polymerases detects promutagenic template－strand uracil［J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，96（16）：9045－9050.