穩(wěn)定沉默黏著斑激酶結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620的構(gòu)建

洪衛(wèi)文，蘇國(guó)強(qiáng)，應(yīng)紅安，林峰，梁衛(wèi)東

（1.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 普外科，浙江 臺(tái)州 318020；2.廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科，福建廈門(mén) 361000；3.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 特需VIP病區(qū)，浙江 臺(tái)州 318020）

黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的高度相關(guān)性已在一些研究中得到證實(shí)[1-2]。FAK在原發(fā)性大腸癌、肝癌組織中高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，并有研究證實(shí)沉默F(xiàn)AK表達(dá)可以抑制乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[3-5]。FAK沉默有望成為結(jié)直腸癌治療的新方法，而目前國(guó)內(nèi)有關(guān)穩(wěn)定沉默F(xiàn)AK的結(jié)腸癌細(xì)胞模型鮮有報(bào)道。本研究應(yīng)用已構(gòu)建的FAK RNA干擾（RNA interference，RNAi)慢病毒載體，通過(guò)包裝293T細(xì)胞產(chǎn)生重組病毒，感染SW620結(jié)腸癌細(xì)胞，并使用新霉素G418篩選穩(wěn)定感染病毒的細(xì)胞株，以建立穩(wěn)定FAK沉默的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620模型。此方法將為進(jìn)一步研究沉默F(xiàn)AK基因表達(dá)對(duì)人轉(zhuǎn)移大腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 慢病毒表達(dá)載體pLentilox3.7、293T細(xì)胞、大腸桿菌DH5α均由廈門(mén)大學(xué)李博安教授惠贈(zèng)。慢病毒包裝系統(tǒng)由pLentilox3.7、PHR、VSVG質(zhì)粒組成。

1.2 主要的儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma），倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、照相顯微鏡（日本Olympus），培養(yǎng)板（美國(guó)Costar），等。試劑：質(zhì)粒小抽提取試劑盒（美國(guó)Qiangen），DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、新生小牛血清、DMEM、G418、NEAA、RMPI 1640（美國(guó)Gibco），氨芐青霉素、TEMED（美國(guó)Sigma），TurboFect（美國(guó)Fermentas），PVDF膜、鼠抗人FAK、Matrigel（美國(guó)Millipore），24孔板、細(xì)胞計(jì)數(shù)板（美國(guó)Costar），Tris（美國(guó)Boehringer Mannheim），SDS（中國(guó)華美生物），羊抗鼠二抗（中國(guó)博士德）。

1.3 方法

1.3.1 重組RNAi質(zhì)粒的擴(kuò)增與提取：向DH5α感受態(tài)細(xì)菌100μL中加入構(gòu)建好的重組RNAi質(zhì)粒，冰浴30 min；42 ℃水浴鍋中熱休克90 s，冰浴2 min，然后鋪于含氨芐霉素（30μg/mL）的瓊脂平板表面，挑單個(gè)菌落，孵育12～16 h，按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取純化質(zhì)粒。

1.3.2 重組FAK RNAi質(zhì)粒的酶切鑒定將重組質(zhì)粒和空載體同時(shí)雙酶切：產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，分析酶切產(chǎn)物，進(jìn)行酶切鑒定。①干擾質(zhì)粒酶和對(duì)照空載體酶切體系：XbaI 1.0μL，NotI 1.0μL，10×M Buffer 2.0μL，質(zhì)粒＜1μg，無(wú)菌水補(bǔ)足至20.0μL，反應(yīng)條件為37 ℃水浴鍋中酶切2～3 h。②酶切產(chǎn)物電泳：預(yù)期結(jié)果為重組質(zhì)粒組504 bp和7146 bp；空載體組為449 bp和7201 bp。1.3.3 慢病毒包裝及滴度測(cè)定：采用改良的陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染法：①轉(zhuǎn)染前1 d將293FT細(xì)胞加入DMEM完全培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液。②依次加入A體系：plasmid（pLL3.7 20μg，PHR 15μg，VSVG 6μg）10μL；B體系：Fermentas TurboFect轉(zhuǎn)染試劑10 μL。③收集細(xì)胞上清加入新鮮的培養(yǎng)基，直到病毒完全被溶解。PBS將DAPI 1000倍稀釋?zhuān)诹魇郊?xì)胞儀下檢測(cè)GFP表達(dá)頻率。病毒滴度（IU/mL）=GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比÷5×1.5×105×103。

1.3.4 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)、分組及重組慢病毒質(zhì)粒感染腫瘤細(xì)胞：SW620細(xì)胞以1640培養(yǎng)基在5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，20～24 h至細(xì)胞融合度達(dá)90%。實(shí)驗(yàn)分三組：實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒的pLL3.7 FAK的SW620細(xì)胞），陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒質(zhì)粒pLL3.7的SW620細(xì)胞），未處理組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的SW620細(xì)胞）。在最佳病毒感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）下感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW620細(xì)胞，感染慢病毒后，隨MOI增加，感染細(xì)胞數(shù)逐漸增加，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定MOI=20，并加入1000×Polybrene 10μL，48 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.3.5 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組慢病毒質(zhì)粒的SW620細(xì)胞株：加入新霉素G418，使?jié)舛冗_(dá)到800μg/mL，取14 d內(nèi)完全殺死細(xì)胞的最低濃度作為篩選濃度，本實(shí)驗(yàn)采用700μg/mL進(jìn)行前2周的篩選，2周后以50μg/mL維持篩選。

1.3.6 采用RT-PCR法檢測(cè)干擾前后FAK的mRNA表達(dá)：①提取細(xì)胞總RNA；②RT反應(yīng)：總RNA 1μg，RT Enzyne MIX 1μL，Primer MIX 1μL，5×RT buffer 4μL，ddH2O 20μL。混勻后，65 ℃ 5min；37 ℃ 20 min；98 ℃ 5 min。③PCR反應(yīng)：FAK正義引物為5’-ACATTATTGGCCACTGTGGATGAG-3’，反義引物為5’-GGCCAGTTTCATCTTGTTGATGAG-3’，擴(kuò)增片段為125 bp；內(nèi)參β-actin 正義引物為5’-GATGCAG AAGGAGATCACTG-3’，反義引物為5’-GGGTGTAACGCAA CTAAGTC-3’，擴(kuò)增片段為222 bp。先94 ℃變性3 min，隨后94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后繼續(xù)72 ℃延伸5 min，4 ℃放置，凝膠電泳并照相。

1.3.7 采用Western blot法檢測(cè)干擾前后FAK的蛋白表達(dá)：①細(xì)胞總蛋白提取。②考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定總蛋白濃度：樣品的蛋白濃度=（樣品的OD值-空白組的OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)品的OD值-空白組的OD值）×5。③蛋白變性：100 ℃變性8 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＂躓estern blot法的具體步驟:按照說(shuō)明書(shū)首先SDS-PAGE垂直電泳，然后蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，最后行抗原-抗體反應(yīng)及化學(xué)發(fā)光顯色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用±s表示，樣本均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒包裝及滴度測(cè)定 熒光倒置顯微鏡觀察可見(jiàn)各組均表達(dá)大量的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），測(cè)定滴度為2.89×107 TU/mL，表明慢病毒包裝成功（見(jiàn)圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h熒光圖（×100）

2.2 各組SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒后熒光圖 相應(yīng)的慢病毒轉(zhuǎn)染入實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組，各組均表達(dá)較多綠色熒光信號(hào)，表明慢病毒轉(zhuǎn)染成功（見(jiàn)圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)綠色熒光圖（×100）

2.3 穩(wěn)定FAK沉默SW620細(xì)胞株的建立 shRNA重組慢病毒感染SW620細(xì)胞后使用濃度800μg/mL G418篩選14 d后實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組細(xì)胞均恢復(fù)生長(zhǎng)，形態(tài)轉(zhuǎn)好，熒光較前亮，同時(shí)熒光率高（見(jiàn)圖 3）。

圖3 穩(wěn)定FAK沉默SW620細(xì)胞株篩選后熒光圖（×100）

2.4 FAK RNAi載體的干擾效率檢測(cè)

2.4.1 RT-PCR檢測(cè)FAK mRNA表達(dá)：以β-actin作為內(nèi)參照，各組細(xì)胞均能擴(kuò)增出約125 bp的FAK基因片段，用Quantity-One定量分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析，測(cè)定出各樣本FAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示各組FAK mRNA表達(dá)分別為：實(shí)驗(yàn)組為1.016±0.047、陰性對(duì)照組為3.971±0.127、未處理組為4.210±0.169，實(shí)驗(yàn)組中FAK mRNA表達(dá)較陰性對(duì)照組、未處理組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 Western blot法檢測(cè)FAK蛋白表達(dá)：以βactin作為內(nèi)參照，用Quantity-One定量分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析，各組FAK蛋白表達(dá)分別為：實(shí)驗(yàn)組為0.374±0.022、陰性對(duì)照組為3.216±0.101、未處理組為2.926±0.142，實(shí)驗(yàn)組中FAK蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組、未處理組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot法檢測(cè)結(jié)果

3 討論

大腸癌是胃腸道常見(jiàn)的惡性腫瘤，致死率高并容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，我國(guó)近年大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是大腸癌患者的主要死因。FAK在整合素介導(dǎo)的細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期和細(xì)胞存活等功能中起關(guān)鍵作用[6-7]，抑制FAK的表達(dá)可有效地降低腫瘤細(xì)胞的黏附和侵襲[8-10]。FAK有望成為新的腫瘤標(biāo)志物、腫瘤治療的重要靶點(diǎn)，為惡性腫瘤的綜合診治提供新的思路。

RNAi具有很強(qiáng)的抑制目的基因的作用，較反義寡核苷酸抑制目的基因的效果更強(qiáng)，被認(rèn)為是繼PCR后又一劃時(shí)代的基因工程方法[11-13]。慢病毒載體可感染非分裂細(xì)胞、目的基因長(zhǎng)期表達(dá)、免疫反應(yīng)小，逐漸成為理想的基因轉(zhuǎn)移載體[14]。本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)，使用慢病毒載體pLL3.7包裝成慢病毒，并用改良的病毒感染方法成功感染SW620結(jié)腸癌細(xì)胞，通過(guò)慢病毒載體自帶的新霉素抗性基因篩選單克隆細(xì)胞，并擴(kuò)增培養(yǎng)，從而構(gòu)建出穩(wěn)定沉默F(xiàn)AK的結(jié)腸癌的細(xì)胞模型，是研究FAK在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等作用機(jī)制中不可或缺的一步。為此，本研究就構(gòu)建FAK的結(jié)腸癌細(xì)胞株進(jìn)行探討性研究，首先在選用結(jié)腸癌細(xì)胞株上，采用的是SW620，此細(xì)胞容易培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度適中，常規(guī)培養(yǎng)條件下能穩(wěn)定傳代，一般12～24 h分盤(pán)一次，另外SW620是從結(jié)腸癌患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中獲取并建立的，惡性程度較高，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，是研究FAK在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的合適的實(shí)驗(yàn)對(duì)象；另外采用的慢病毒載體pLL3.7為病毒載體，帶有GFP及新霉素抗性基因，可以在體外甚至體內(nèi)示蹤細(xì)胞，方便細(xì)胞感染后篩選目的細(xì)胞，并且具有FAK基因沉默效率高、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)Western blot法檢測(cè)FAK蛋白表達(dá)下降90%以上，感染細(xì)胞通過(guò)多次的傳代后FAK表達(dá)始終處于低水平，有效減少后期實(shí)驗(yàn)誤差；病毒感染細(xì)胞是通過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用不同藥物及劑量對(duì)照，最終選定Fermentas TurboFect轉(zhuǎn)染試劑及最合適的劑量成功感染SW620細(xì)胞，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)感染率極高，感染后細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制。在細(xì)胞篩選過(guò)程中利用質(zhì)粒中的neo抗性基因，使用不同劑量G418階梯篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)后，采用最合適的劑量對(duì)感染后細(xì)胞進(jìn)行篩選，并選取熒光表達(dá)高的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，目的細(xì)胞能穩(wěn)定傳代擴(kuò)增，從而最終構(gòu)建了穩(wěn)定沉默F(xiàn)AK的結(jié)腸癌細(xì)胞株；本細(xì)胞株的構(gòu)建為下一步體外研究FAK基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用及相關(guān)機(jī)制提供前提，并為進(jìn)一步將FAK沉默的腫瘤細(xì)胞移植至裸鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

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