乙型肝炎病毒誘導HLA-G的表達及其臨床意義

周林杰，鄭貞蒼，王鑫，陳鵬

（恩澤醫療中心路橋醫院 重癥監護室，浙江 臺州 318050）

人類白細胞抗原-G（human leukocyte antigen-G，HLA-G）是機體內一個重要的免疫耐受分子，屬于非經典HLA I分子。在正常情況下，HLA-G分子表達具有組織特異性，僅在絨毛外滋養層細胞、角膜細胞等少數免疫豁免組織上表達。隨著研究的不斷深入，發現HLA-G分子在多種病理條件下（如病毒、炎癥、腫瘤、自身免疫病等）能夠獲得誘導性表達，并發揮重要的免疫逃逸功能[1]。一方面，HLAG能夠與免疫細胞上表達的受體結合，直接抑制如自然殺傷細胞、T淋巴細胞的殺傷活性；另一方面，HLA-G能夠誘導產生具有免疫抑制活性的調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）等，間接發揮免疫抑制功能[2]。近來有研究表明，羊膜內感染或組織絨毛膜羊膜炎的早產或正常分娩孕婦羊水中可溶性HLA-G（soluble HLA-G，sHLA-G）分泌水平要高于正常孕婦羊水sHLA-G的表達，推測sHLA-G可能在宿主抗羊膜炎癥反應的過程中發揮重要的作用[3]。此外，在肌炎患者炎癥部位的骨骼肌中或急性神經炎癥患者腦脊髓液中均發現HLA-G+T淋巴細胞的存在，且比例較高，表明HLA-G在機體內調節炎癥反應過程中發揮了重要的功能[4]。本研究通過檢測54例乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染患者及63例正常獻血員外周血HBV的載量及sHLA-G的含量；將不同載量的HBV體外刺激單核細胞，采用RT-PCR、Western blot和流式細胞術檢測HLA-G抗原的誘導表達情況，旨在探討HBV誘導單核細胞HLA-G的表達及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集2011年3月-9月在本院住院治療的HBV感染患者54例，其中男30例，女24例，年齡20～72歲，平均（46.5±21.6）歲。所有患者血清谷丙轉氨酶（ALT）/谷草轉氨酶（AST）持續或間歇升高，黃疸及凝血酶原時間均提示患者處于免疫清除期。住院前未口服過抗病毒藥物或免疫調節藥物，住院后馬上抽血保存于-20 ℃冰箱內。經乙肝三系檢測為HBV感染患者，且乙肝三系定量檢測乙肝表面抗原普遍大于250 IU/mL、乙肝e抗原為0.3～1 431 S/CO。臺州市血站提供2012年3月-6月的乙肝三系、肝功能與轉氨酶均正常的獻血員63例作為對照，其中男33例，女30例，年齡23～45歲，平均（34.2±9.1）歲。

1.2 方法

1.2.1 HBV載量測定：采用實時RT-PCR的方法測定54例HBV感染患者和63例正常獻血員外周血HBV的載量。HBV核酸擴增熒光定量檢測試劑盒購自申友生物，血清病毒載量低于1 000拷貝/mL將不能被檢測，實驗操作及分析嚴格按照說明書執行。

1.2.2 血漿sHLA-G檢測：采用ELISA法檢測HBV感染患者血漿sHLA-G的含量。sHLA-G試劑盒購自biovendor公司（RD194070100R）。

1.2.3 細胞培養及病毒感染：單核細胞株THP-1細胞和含HBV的人肝細胞DCX細胞購自中科院上海研究所。大量培養DCX細胞，收集約1×108個細胞，置于凍存管中，反復凍融細胞，采用病毒核酸抽提試劑盒無菌抽提HBV，經實時PCR檢測HBV載量，調整載量為1×108拷貝/mL、1×107拷貝/mL、1×106拷貝/mL、1×105拷貝/mL、1×104拷貝/mL及PBS分別與THP-1細胞共培養，培養時間分別為1、2、3、4、5、6 d。收集處理后的細胞，分別經RT-PCR、Western Blot和流式細胞術檢測HLA-G誘導表達情況。

1.2.4 采用RT-PCR技術檢測經HBV誘導后的單核細胞HLA-G異構體轉錄情況：收集上述處理后細胞，抽提總RNA，按Fermentas公司反轉錄酶試劑盒說明書操作，合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，分別應用HLA-G1～G6和pan HLA-G引物進行PCR擴增（引物序列見表1），條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s及68 ℃ 1 min，共40個循環，最后于72 ℃延伸10 min。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

表1 RT-PCR擴增HLA-G異構體mRNA的引物序列

1.2.5 采用Western blot法檢測經HBV誘導單核細胞胞內HLA-G表達情況：取上述細胞制備細胞裂解液，分別取10μL作SDS-PAGE，電轉膜后，用1% BSA室溫封閉過夜。加入HLA-G特異性抗體4H84（1:1 000），4 ℃過夜。0.1% PBST洗滌3次，加入HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育30 min，0.1%PBST洗滌3次，加入底物顯色。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS16.0軟件進行統計學分析。HBV感染患者sHLA-G濃度用±s表示，組間比較采用t檢驗，若兩組數據方差不齊，則采用Satterthwaite近似t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBV載量 HBV感染患者HBV載量均大于1×104拷貝/mL，而正常獻血員則小于100拷貝/mL。

2.2 外周血sHLA-G表達水平 HBV感染患者血漿sHLA-G表達水平為（118.127±60.325）U/mL，而正常獻血員為（8.484±5.129）U/mL，HBV感染患者血漿sHLA-G表達水平顯著高于正常獻血員，兩者差異有統計學意義（P＜0.01，95%CI：88.5～130.74）。2.3 HBV誘導HLA-G基因轉錄增強及誘導HLA-G蛋白表達 將1×108拷貝/mL、1×107拷貝/mL、1×106拷貝/mL、1×105拷貝/mL、1×104拷貝/mL的HBV及PBS分別與THP-1細胞共培養24 h，結果表明，HBV載量為1×107拷貝/mL和1×108拷貝/mL誘導HLA-G1異構體轉錄增強。采用1×108拷貝/mL HBV載量與THP-1細胞分別培養1、2、3、4、5、6 d，結果表明，在HLA-G1轉錄及蛋白表達在第4天達到最高（見圖1-2）。此外，研究發現HBV誘導前后THP-1細胞均未轉錄HLA-G5 mRNA異構體。

圖1 RT-PCR技術檢測HBV誘導THP-1細胞HLA-G1～G6和pan HLA-G表達情況

圖2 Western blot技術檢測HBV誘導THP-1細胞HLA-G蛋白表達情況

3 討論

HLA-G是機體內一個重要的免疫耐受分子，炎癥、病毒感染后均可誘導HLA-G分子的表達，促進炎癥和病毒的免疫逃逸[5-6]。在此次研究中發現，HBV感染患者血漿sHLA-G抗原表達水平顯著高于正常獻血員（P＜0.01），表明sHLA-G可能是HBV感染的潛在有效標志物之一。

到目前為止，HBV感染患者未能完全清除體內病毒，與HBV通過多種機制破壞機體免疫平衡系統相關。而誘導HLA-G表達從而抑制樹突狀細胞、自然殺傷細胞、病毒特異性CD4+和CD8+T淋巴細胞等是HBV逃避機體免疫攻擊的有效機制之一。研究發現，干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、白細胞介素-2、白細胞介素-10、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、白細胞抑制因子、激素（黃體酮、糖皮質激素等）等均能誘導HLA-G的表達和增加sHLA-G的分泌[7-9]。HBV感染患者血漿sHLA-G分泌水平較正常人顯著升高，其誘導sHLA-G分泌機制還需進一步研究。因此，我們將HBV與THP-1細胞共同培養，結果表明，HBV載量為1×107拷貝/mL和1×108拷貝/mL誘導HLAG1異構體轉錄增強。采用1×108拷貝/mL HBV載量與THP-1細胞分別培養1、2、3、4、5、6 d，結果表明，在HLA-G1轉錄及蛋白表達在第4天達到最高。本研究初步發現，HBV通過體外感染THP-1細胞誘導sHLA-G分泌，而非通過細胞因子或激素等誘導。此外，HBV誘導HLA-G表達機制還需進一步研究。

Rebmann等[10]研究表明，血漿sHLA-G可能是HLA-G5或者是脫落的HLA-G1。本研究的sHLA-G ELISA試劑盒是用MEM-G/9包被而成，既能識別脫落的HLA-G1，也能識別HLA-G5，兩種含有β2-微球蛋白。在此次研究中，HBV誘導前后THP-1細胞均未轉錄HLA-G5 mRNA異構體，提示HBV感染患者分泌的sHLAG可能是脫落的HLA-G1抗原。通過本次研究表明，HBV感染患者sHLA-G分泌水平顯著高于正常獻血員，而其機制可能是HBV增強單核細胞HLA-G基因轉錄，誘導單核細胞表達HLA-G蛋白，從而使HLA-G參與調節HBV免疫逃逸。

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