穴位埋線對失眠大鼠下丘腦單胺類遞質及IL-1b、TNF-a含量的影響

郭愛松,劉春,李百勝,朱振杰,陳偉觀,李愛紅

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穴位埋線對失眠大鼠下丘腦單胺類遞質及IL-1b、TNF-a含量的影響

郭愛松1,劉春2,李百勝2,朱振杰1,陳偉觀1,李愛紅1

(1.南通大學附屬醫院,南通 226001;2.南通大學,南通 226001)

觀察穴位埋線對失眠大鼠下丘腦組織中單胺類神經遞質5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)及細胞因子白細胞介素-1b(IL-1b)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)含量的影響,探討穴位埋線治療失眠的作用機理。將40只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、安定組、針刺組和埋線組,每組8只。實驗第1天,應用對氯苯丙胺酸(PACA)制作失眠大鼠模型。實驗第3天開始,安定組用安定注射液腹腔注射治療,每日1次,連續5 d;針刺組用毫針針刺治療,每日1次,連續5 d;埋線組用穴位埋線治療1次。各組均于實驗第7天治療后1 h處死大鼠取下丘腦組織,采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組下丘腦組織中5-HT、DA、NE及IL-1b、TNF-a含量。實驗第7天,模型組大鼠下丘腦組織中5-HT及IL-1b、TNF-a含量明顯低于空白對照組,DA、NE含量高于空白對照組,差異均具有統計學意義(＜0.05)。與模型組比較,安定組、針刺組、埋線組5-HT含量均升高,DA、NE含量均降低,差異均具有統計學意義(＜0.05);安定組、針刺組、埋線組之間比較,埋線組下丘腦5-HT及DA、NE含量改變情況優于安定組及針刺組(＜0.05),安定組和針刺組之間比較差異均無統計學意義(＞0.05)。與模型組比較,針刺組和埋線組IL-1b、TNF-a含量均升高,埋線組優于針刺組(＜0.05)。穴位埋線改善失眠的作用機制可能與調節下丘腦組織單胺類神經遞質5-HT、DA、NE及細胞因子IL-1b、TNF-a含量有關。

針刺療法;穴位療法;埋線;失眠癥;單胺類神經遞質;白細胞介素-1b;腫瘤壞死因子-a;大鼠

失眠癥是指患者對睡眠時間和(或)質量不滿足并影響白天社會功能的一種主觀體驗。隨著經濟和社會的發展,人們的生活和工作壓力不斷增大,失眠的患病率有不斷增加的趨勢,已成為嚴重影響人們生活質量、人際交往和導致工作效率下降的重要因素,失眠的治療方法及機制已成為目前醫學界重要的研究課題。有研究[1-3]認為,針刺具有增加失眠患者睡眠時間,改善睡眠質量、睡眠結構等作用,針刺的方法主要運用傳統體針法、頭皮針法等,這些針刺方法主要利用反復多次的針刺方式刺激經穴取得治療效果,療效持續時間短、患者的依從性不好,這在一定程度上影響了針刺治療失眠的臨床療效。

穴位埋線采用穴位線體植入的方式,借助埋入線體對穴位持續刺激作用替代傳統針刺,這不僅是傳統針具的革新,同時也是治療模式的重大改進,埋線療法使針刺治療從短效反復治療模式發展到了長效治療模式,尤其用于治療失眠等慢性頑固性疾病[4-6]。研究發現單胺類神經遞質及細胞因子參與睡眠的調節,本實驗通過檢測下丘腦單胺類神經遞質5-羥色胺(5- HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)及細胞因子白細胞介素-1b(IL-1b)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)含量的影響,探討穴位埋線治療失眠的作用機理,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年大鼠40只,雌雄各半,質量180～200 g,由南通大學實驗動物中心提供[實驗動物生產許可證SCXK(蘇)2008-0010]。在相同條件下分籠飼養,自然光照,動物房內溫度(20±3)℃,相對濕度為40%～60%,適應性喂養7 d后,隨機分為空白對照組、模型組、安定組、針刺組、埋線組,每組8只。

1.2 動物模型制備

參照文獻[7],采用對氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射的方法,PCPA為美國Sigma公司產品(批號Cas14173 -39-8)。PCPA臨用前按大鼠300 mg/kg用量,用弱堿性生理鹽水配置成混懸液備用(30 mg/100 mL),腹腔注射PCPA混懸液(1 mL/100 g)。實驗第1天注射1次,連續2 d。于第1次腹腔注射24～28 h后,動物出現晝夜節律消失,活動不停,表明模型復制成功。

1.3 處理方法

①空白對照組不造模,自然喂養及活動。②模型組于實驗第1天開始造模,造模成功后,實驗第3天開始同空白對照組。③安定組于實驗第1天開始造模,造模成功后,實驗第3天開始給予地西泮(安定)注射液腹腔注射治療。給藥劑量按成人催眠劑量10 mg/d,用人鼠給藥劑量體表面積折算公式計算出大鼠給藥劑量為每日0.92 mg/kg。每日1次,連續治療5 d。④針刺組于實驗第1天開始造模,造模成功后,實驗第3天給予毫針針刺治療,穴位處方為神門、三陰交、百會(取穴參照人體有關穴位及動物取穴方法[8])。針刺方法為每日下午4～6時,將大鼠捆綁于自制的大鼠針刺用固定器中,采用0.35 mm×25 mm毫針行手針刺激。針刺百會向前斜刺百會穴約1 cm,直刺神門、三陰交穴約0.5 cm,留針20 min。每日治療1次,連續5 d。⑤埋線組于實驗第1天開始造模,造模成功后,實驗第3天開始穴位埋線治療1次,埋線穴位同針刺組,埋線針具為一次性使用無菌1 mL注射器針尖及一次性使用無菌0.35 mm×25 mm毫針。穴位埋線根據穴位的可刺深度,先將無菌4/0號0.5～1 cm長度醫用羊腸線放入1 mL注射器針尖內,穴位局部消毒后繃緊皮膚,將針頭刺入穴位,深度和針刺組相同,再用毫針將醫用羊腸線推入穴位內后按壓針孔。

1.4 標本及檢測

各組于實驗第7天,治療后1 h,斷頭處死大鼠,在枕骨大孔處迅速剪斷延髓,去顱骨,完全暴露腦組織,取出腦組織,在冰冷平皿上去大腦、小腦,將分離出的下丘腦在冰冷生理鹽水中洗去血液,濾紙拭干稱重,加入一定量PBS液(pH值為7.2～7.4)后,用液氮迅速冷凍備用。標本融化后,按20:1加入PBS液,用勻漿器將標本勻漿充分,離心20 min(2000～3000轉/min),收集上清。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定5-HT,DA,NE 及IL-1b、TNF-a含量,試劑盒由上海森雄科技實業有限公司提供,由專人按說明書操作。

1.5 統計學方法

所有數據結果均采用SPSS11.0統計軟件進行統計分析,數據采用均數±標準差表示,采用檢驗。以＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 對大鼠自發行為的影響

正常大鼠在連續以300 mg/kg的PCPA腹腔注射2 d后,睡眠-覺醒的晝夜節律消失,說明模型復制成功。行為學表現為大鼠正常的睡眠活動消失,白天也活動不停,且容易激惹。經過安定、針刺及穴位埋線干預后大鼠的睡眠-覺醒節律開始恢復,白天活動少,安靜、蜷臥、不易被外界驚醒,埋線組大鼠失眠改善尤為明顯,模型組大鼠失眠無明顯改善。

2.2 各組大鼠下丘腦單胺類遞質的含量比較

實驗第7天,模型組大鼠下丘腦組織中5-HT的含量明顯低于對照組,DA、NE高于對照組,差異均具有統計學意義(＜0.05);安定組、針刺組、埋線組5-HT的含量均升高,DA、NE均降低,與模型組比較差異均有統計學意義(＜0.05);安定組、針刺組、埋線組之間比較,埋線組優于安定組及針刺組(＜0.05),安定組和針刺組之間比較差異均無統計學意義(＞0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠下丘腦單胺類遞質的含量比較 (±s,ng/L)

注:與空白對照組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05;與埋線組比較3)＜0.05

2.3 各組大鼠下丘腦IL-1b、TNF-a含量比較

實驗第7天,模型組大鼠下丘腦組織中IL-1b、TNF-a的含量明顯低于對照組。與模型組比,安定組IL-1b、TNF-a含量差異無統計學意義(＞0.05),針刺組、埋線組的IL-1b、TNF-a含量均升高,差異均具有統計學意義(＜0.05),埋線組優于針刺組(＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠下丘腦IL-1b、TNF-a含量比較 (±s,ng/L)

注:與空白對照組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05;與針刺組比較3)＜0.05

3 討論

失眠,中醫學亦稱之為“目不暝”、“不得眠”或“不寐”,多因飲食不節、情志失常、勞逸失調及病后體虛所致心膽脾腎的陰陽失調,氣血失和。病理性質總屬陽盛陰衰、陰陽失交,一為陰虛不能納陽,一為陽盛不得入于陰,病位主要在心,并與肝脾腎相關。現代醫學認為失眠原因較多,有社會環境、心理生理及軀體等因素,發生機制與中樞神經系統眾多的神經網絡和一系列神經介質、神經內分泌和神經調節物質有關。

研究發現單胺類神經遞質及細胞因子IL-1b、TNF-a等參與睡眠機制的調節。單胺類神經遞質主要包括5-HT和兒茶酚胺,后者主要指DA、NE和腎上腺素。5-HT是目前較為公認的參與睡眠-覺醒機制的經典神經遞質,被認為是腦內的“致眠因子”,對慢波睡眠的發生和維持起著重要作用。DA在腦內主要起興奮作用,對睡眠具抑制作用,NE作為腦干網狀結構上行激動系統的重要部分,主要與快速動眼相(REM)睡眠及覺醒的維持有關[9]。在中樞神經系統內5-HT、DA及NE能神經元數量較少,其胞體大多聚集于腦干離散區域,形成集群或核團;但是其軸突分布廣泛,可支配腦的所有區域,能通過同時調制中樞神經系統廣泛區域的突觸活動而調控腦的總體功能,下丘腦內存在“睡眠中樞”和“覺醒中樞”,下丘腦與腦干處的相關區域相互作用,共同完成睡眠與覺醒的調節[10-11]。

細胞因子不但是重要的免疫調節因子,而且具有廣泛的中樞調節作用,研究表明細胞因子IL-1、TNF能通過不同線路影響中樞神經系統的睡眠過程。外源性補充(靜脈或腦室注射)IL-1后,可增加大鼠、小鼠及猴等的非快速動眼(NREM)睡眠時間;反之,若用抑制IL-1生成的物質或IL-IR拮抗劑或IL-1抗體抑制內源性IL-1活性作用,可抑制自發性睡眠,并可抑制睡眠剝奪后的睡眠反彈。IL-1分子結構可分為IL-1a和IL-1b兩種形式,IL-1b在腦內分布較為廣泛,IL-1b可調節大鼠下丘腦前區NE、5-HT和DA的釋放,通過促進慢波睡眠,參與睡眠調節[12]。TNF參與NREM睡眠的調節,外源性補充TNF可使大鼠、小鼠及兔的NREM睡眠增加,其促進睡眠機制在于TNF可增加腦中5-HT及其代謝產物5-羥吲哚乙酸的含量,增強中樞5-HT系統的功能。此外,TNF與IL-1對睡眠的調節有密切關系,有許多刺激因素可同時誘導兩者的釋放,而TNF與IL-1還能夠互相誘導對方的產生,在睡眠調節中,兩者似乎來源于同一個功能性基因組[13-14]。

本實驗通過腹腔注射PCPA復制大鼠失眠狀態, PCPA失眠鼠模型是目前公認的,并廣泛用于5-HT及其與其他遞質之間關系研究的經典動物模型[7]。本實驗結果顯示,模型組大鼠下丘腦組織中5-HT、IL-1b、TNF-a的含量明顯低于對照組,DA、NE高于對照組,差異均具有統計學意義(＜0.05),說明PCPA造模后,影響了下丘腦單胺類神經遞質5-HT、DA、NE及細胞因子IL-1b、TNF-a的分泌,故5-HT、DA、NE及IL-1b、TNF-a含量失調成為大鼠失眠的原因之一。與模型組比,經過安定、針刺、穴位埋線治療后3組5-HT的含量均升高,DA、NE均降低,差異均具有統計學意義(＜0.05),埋線組5-HT、DA、NE的改變情況優于安定組及針刺組(＜0.05);與模型組比,安定組IL-1b、TNF-a含量無明顯變化(＞0.05),而針刺組及埋線組IL-1b、TNF-a含量增高,且埋線組優于針刺組(＜0.05)。表明應用安定、針刺、埋線均能調節單胺類遞質的分泌平衡,抑制覺醒和興奮促進睡眠,調節睡眠-覺醒周期平衡。另外,針刺及穴位埋線能夠調節睡眠相關細胞因子含量從而調節睡眠,從而提示針刺、埋線治療失眠可以針對失眠的多種因素,具有整體調整、多靶點治療優點。

研究發現,穴位埋線療效優于針刺治療,這可能與穴位埋線的治療特點有關。穴位埋線療法是在中醫學經絡理論的指導下,用特制的醫療器具將醫用羊腸線埋入相應穴位區域,通過針具和羊腸線在穴位內產生刺激,產生較一般針刺方法更為強烈而持久的針刺效應。羊腸線作為一種異體蛋白埋入機體后,逐漸被機體軟化吸收,起組織療法的作用,且刺激持久,能更好地調節機體內環境的相對平衡,提高機體的調節能力。埋線主穴取神門、三陰交、百會。神門為心經原穴,心主血脈、藏神,取之可養血寧心、安神定志。三陰交穴與神門相配則具有鎮靜安神作用,對失眠有良好的治療作用百會屬于督脈穴,位于巔頂,聯系腦,是調節大腦功能的要穴,臨床常用于治療失眠及各種神志病。諸穴配伍,共同發揮鎮靜安眠、協調陰陽、標本兼治的作用。在臨床失眠的治療中,穴位埋線具有使用簡便、療效好、無副反應等優點,越來越受到患者歡迎[5]。本研究結果表明,穴位埋線治療失眠的機理可能與增加下丘腦中樞單胺類神經遞質5-HT及細胞因子IL-1b、TNF-a含量,降低DA及NE含量有關。

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Effect of Acupoint Catgut Embedding on Hypothalamic Monoamine Neurotransmitter, IL-1band TNF-aContents in Insomnia Rats

-1,2,-2,-2,-1,-1.

1.,226001,; 2.,226001,

To investigate the effect of acupoint catgut embedding on hypothalamic monoamine neurotransmitters 5-hydroxytryptamine (5-HT), dopamin (DA) and norepinephrine (NE), and cytokine interleukin-1b(IL-1b) and tumor necrosis factor-a(TNF-a) contents in insomnia rats and explore the mechanism of acupoint catgut embedding treatment for insomnia.Forty SD rats were randomly allocated to blank control, model, diazepam, acupuncture, catgut embedding groups, 8 rats each. On the first day of experiment, a rat model of insomnia was made with para-chlorophenylalanine (PCPA). From the third day of experiment, the diazepam group was intraperitoneally injected with diazepam once daily, for five consecutive days; the acupuncture group was treated with filiform needle acupuncture once daily, for five consecutive days; the catgut embedding group was treated by acupoint catgut embedding for one time. On the seventh day of experiment, the rats of every group were sacrificed and the hypothalami were taken at one hour after treatment. Hypothalamic 5-HT, DA, NE, IL-1band TNF-acontents were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in every group.On the seventh day of experiment, hypothalamic 5-HT, IL-1band TNF-acontents were significantly lower and DA and NE contents were higher in the model group of rats than in the blank control group; there were statistically significant differences (＜0.05). The 5-HT content increased and the DA and NE contents decreased in the diazepam, acupuncture and catgut embedding groups compared with the model group (＜0.05). Changes in hypothalamic 5-HT, DA and NE contents were more marked in the catgut embedding group than in the diazepam and acupuncture groups (both＜0.05) and there were statistically significant differences between the diazepam and acupuncture groups (＞0.05). The IL-1band TNF-acontents increased in the acupuncture and catgut embedding groups compared with the model group and increased more in the catgut embedding group than in the acupuncture group (＜0.05).The mechanism by which acupoint catgut embedding improves insomnia may involve its regulation of hypothalamic monoamine neurotransmitters 5-HT, DA and NE, and IL-1band TNF-acontents.

Acupuncture therapy; Acupoint therapy; Acupoint catgut embedding; Insomnia; Monoamine neurotransmitters; Cytokine interleukin-1b; Tumor necrosis factor-a; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.07.0672

江蘇省南通市社會發展科技計劃項目(S2010006)

郭愛松(1971 - ),男,副主任醫師,碩士生導師

李愛紅(1970 - ),女,主任醫師,E-mail:liaihongbox@ 163.com

1005-0957(2014)07-0672-04

2013-12-14