hnRNP A1的增強型綠色熒光標記及細胞應激定位分析*

高星杰 宋 娟 葛 林 付 雪 孫曉明 張 緯何津巖 姚 智 楊 潔,△

hnRNP A1的增強型綠色熒光標記及細胞應激定位分析*

高星杰1宋 娟2葛 林2付 雪1孫曉明2張 緯2何津巖3姚 智4楊 潔1,2△

目的 構建包含有核不均一核糖核蛋白（hnRNP）A1蛋白編碼區序列的真核表達質粒pEGFP-C1-hnRNP A1，并對增強型綠色熒光蛋白（EGFP）標記的hnRNP A1蛋白進行細胞應激共定位分析。方法提取HeLa細胞總RNA，以針對hnRNPA1-3′非翻譯區的特異性片段為反轉錄引物，反轉錄出包含hnRNP A1編碼區序列的cDNA，并以其為模板，降落PCR法擴增出帶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切位點的目的基因，利用雙酶切法分別酶切目的基因片段和線性pEGFP-C1，在T4-DNA連接酶的催化下將兩者連接構建成pEGFP-C1-hnRNP A1重組質粒，然后將重組質粒轉染入HeLa細胞內，以激光共聚焦熒光顯微鏡觀察EGFP-hnRNP A1的熒光表達情況，Western印跡法檢測EGFP與hnRNP A1的融合表達情況，最后進行細胞原位雜交及細胞免疫熒光檢測在氧化應激狀態下EGFP-hnRNP A1蛋白與poly(A)+mRNA（應激顆粒的標記成分）及DPC1a（加工體的標記蛋白）的應激共定位。結果以單/雙酶切及基因測序法鑒定構建的重組質粒無誤，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察和Western印跡結果檢測到綠色熒光融合蛋白的表達；EGFP-hnRNP A1蛋白與poly(A)+mRNA呈現共定位，但與DPC1a無共定位關系。結論重組pEGFP-C1-hnRNP A1質粒成功構建并表達，應激狀態下EGFP標記的hnRNP A1參與應激顆粒的構成。

核糖核蛋白類，核不均一；綠色熒光蛋白質類；膜融合蛋白質類；hnRNP A1蛋白；pEGFP-C1；融合蛋白；應激顆粒

核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）A1是hnRNP蛋白家族中的重要一員。學者們已從不同角度探討hnRNP A1蛋白在選擇性剪接、mRNA代謝、端粒酶激活、凋亡調控等過程中的重要作用，然而從細胞水平探討hnRNP A1細胞應激功能的相關研究尚少見[1-3]。本研究采用pEGFP-C1質粒載體，旨在構建pEGFPC1-hnRNP A1重組質粒，在真核細胞內表達攜帶有增強型綠色熒光蛋白（EGFP）標簽的hnRNP A1蛋白，并進行細胞應激時的熒光定位分析，為深入研究多功能hnRNP A1蛋白的生物學功能提供便利工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株及細胞 pEGFP-C1載體購自美國Clontech公司；Trans1-T1感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；HeLa細胞為本實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA連接酶均購自Fermentas公司；Taq酶購自北京鼎國昌盛生物技術公司；T/A載體（pEASY-T1）購自北京全式金生物技術有限公司；DNA快速凝膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限公司；質粒快速小提試劑盒購自北京索來寶科技有限公司；去內毒素質粒提取試劑盒購自Promega公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。BCA蛋白測定試劑盒購自Pierce公司；單克隆鼠源抗EGFP抗體購自MBL公司；多克隆兔源抗DCP1a抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的抗鼠源IgG二抗購自Fermentas公司；Alexa Fluor 546標記的抗兔源IgG熒光二抗購自Invitrogen公司；LumiGLo化學發光底物購于KPL公司；DAPI染料購自Santa公司；TAMRA-oligo(dT)30購自生工生物工程公司；激光共聚焦皿購自NEST公司。激光共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus公司），引物合成及基因測序工作由北京天一輝遠公司完成。

1.2 方法

1.2.1 獲取目的基因片段 培養HeLa細胞，提取RNA，以“GTGAACTCAGCCAAG CACAGTGGT”為引物進行hnRNP A1 cDNA的反轉錄，然后根據hnRNP A1的蛋白編碼區序列（NM_002136.2）設計含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶位點的引物序列，上游:5′-CCGGAATTCCATGTCTAAGTCAGAGTCTCCTA-3′；下游:5′-CGCGGATCCTTAAAAT CTTCTGCCACTGCC-3′。再以含hnRNP A1序列的cDNA為模板，降落PCR擴增目的片段，條件為95℃預變性5 min，95℃30 s，65℃45 s，72℃3 min，每循環降低1℃，共15個循環，再以50℃進行20個循環，72℃延伸10 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進行目的片段回收，在T4 DNA連接酶作用下，與pEASY-T1（T/A載體）25℃連接15 min。連接產物轉化Trans1-T1感受態細胞，在含有氨芐/卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取質粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化各目的片段。

1.2.2 線性pEGFP-C1的獲取 以質粒快速小提試劑盒提取pEGFP-C1質粒DNA，進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，完整切下線性pEGFP-C1質粒載體，1%瓊脂糖電泳分離。凝膠回收試劑盒回收得到約4 700 bp線性pEGFP-C1。

1.2.3 重組真核表達質粒pEGFP-C1-hnRNP A1的構建 在T4 DNA連接酶作用下，將線性pEGFP-C1質粒載體與具有相同黏性末端的hnRNP A1功能片段進行22℃連接過夜。連接產物轉化Trans1-T1感受態細胞，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取重組質粒。

1.2.4 單、雙酶切及基因測序鑒定 用EcoRⅠ和BamHⅠ對重組質粒pEGFP-C1-hnRNP A1進行單、雙酶切，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證片段的大小。同時，對重組質粒進行基因測序鑒定。

1.2.5 HeLa細胞的轉染及熒光觀察 以去內毒素質粒提取試劑盒提取無內毒素pEGFP-C1-hnRNP A1重組質粒。HeLa細胞接種至激光共聚焦皿中，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，37℃、5%的CO2培養箱中培養，至細胞80%匯合時，依據產品說明書進行脂質體瞬時轉染重組質粒。轉染后48 h，加500 μL 1 g/L DAPI室溫避光孵育3 min，PBS洗滌3次，以激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞內的熒光信號。

1.2.6 Western印跡檢測融合蛋白表達 分別轉染pEGFPC1-hnRNP A1重組質粒及pEGFP-C1對照質粒后48 h，先以預冷的1×PBS溶液洗滌轉染后HeLa細胞3次，加入預冷的1×NP-40裂解液裂解細胞，晃動培養板數次以確保裂解液完全覆蓋細胞，用無菌的細胞刮刮取細胞并轉移至1個1.5 mL Eppendorf管中，冰浴20 min。超聲破碎細胞后4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清獲得全細胞裂解液，以BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。裂解液中加入SDS上樣緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl pH6.8，2%SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油，2.5% β-巰基乙醇），99℃熱變性5 min，進行8%SDS-PAGE電泳。電泳結束后，以半干轉法將凝膠上蛋白轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，鼠源抗人EGFP單克隆一抗4℃孵育過夜。TBST溶液洗膜4次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠源IgG二抗室溫孵育2 h，TBST溶液再次洗膜4次，每次15 min。加入LumiGLo化學發光底物后暗室曝光。

1.2.7 原位雜交實驗 將轉染后細胞分為處理組與未處理組，處理組為0.5 mmol/L亞砷酸鹽處理1 h。以溫PBC洗滌3次，顯微鏡下觀察無死細胞及雜質；4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，5 min/次；加500 μL 1 g/L DAPI室溫避光孵育3 min，PBS洗滌3次，5 min/次；加入1 mL含0.5%TritonX-100的PBS溶液，室溫靜置10 min；加入0.5 μmol/L TAMRA-oligo(dT)30，46℃濕盒雜交過夜。以含25%甲酰胺的0.5×SSC室溫洗滌3次，5 min/次；以4×SSC洗滌2次，5 min/次；以2× SSC洗滌1次，5 min；以1×SSC洗滌1次，5 min；加1 mL DEPC高壓水，最后以激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞內的熒光信號。每組實驗重復3次。

1.2.8 細胞免疫熒光實驗 轉染pEGFP-C1-hnRNP A1重組質粒后48 h，分為處理組（0.5 mmol/L亞砷酸鹽，1 h）與非處理組。4%多聚甲醛室溫固定10 min，加500 μL 1 g/L DAPI室溫避光孵育3 min，PBS洗滌3次，5 min/次；0.2%通透液（含0.2%Triton X-100的PBS）室溫靜置通透10 min；再加入1% BSA封閉1 h。加入多克隆兔源抗DCP1a（1∶100）的一抗4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，10 min/次。再加入Alexa Fluor 546標記的抗兔源IgG熒光二抗（1∶800）4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，10 min/次。最后以激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞內的熒光信號。每組實驗檢測50～100個細胞分別重復3次。

2 結果

2.1 PCR擴增目的片段 培養HeLa細胞，提取RNA后針對hnRNP A1反轉錄出cDNA，并以其為模板進行PCR擴增，以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，結果在963 bp左右觀察到與目的片段長度相符的熒光條帶，見圖1。

Figure 1 Obtain of targeting hnRNP A1 fragment圖1 目的片段hnRNP A1的獲取

2.2 線性pEGFP-C1質粒載體的獲取 EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pEGFP-C1質粒，切下完整的線性pEGFP-C1質粒載體，見圖2。經1%瓊脂糖凝膠電泳，在4 700 bp左右出現條帶，見圖3。純化回收后用于后續的連接反應。

Figure 2 The map of pEGFP-C1 vector圖2 pEGFP-C1載體圖譜

Figure 3 Obtain of linear pEGFP-C1 vector圖3 線性pEGFP-C1質粒載體的獲取

2.2.1 重組真核表達質粒pEGFP-C1-hnRNP A1的鑒定 將構建的重組質粒分別進行EcoRⅠ和BamHⅠ的單、雙酶切，產生的條帶大小與預期相符，見圖4，重組質粒基因測序結果也正確。

Figure 4 Single/double enzyme digestion of pEGFP-C1-hnRNP A1圖4 pEGFP-C1-hnRNP A1的單、雙酶切鑒定圖

2.2.2 重組真核表達質粒pEGFP-C1-hnRNP A1的熒光表達 激光共聚焦熒光顯微鏡下可見轉染的pEGFP-C1-hnRNP A1重組質粒能夠表達EGFP-hnRNP A1，且主要在胞核中分布，見圖5。

2.2.3 Western印跡法檢測融合蛋白表達 收集轉染有pEGFP-C1-hnRNP A1和pEGFP-C1的HeLa細胞，以針對EGFP的單克隆抗體分別檢測EGFP-hnRNP A1融合蛋白和EGFP的表達。hnRNP A1蛋白分子質量為34.2 ku，EGFP為26.7 ku，兩者融合后為60.9 ku。Western印跡法檢測出與目的融合蛋白分子質量相符的蛋白條帶，見圖6。

Figure 6 The data of Western blotting圖6 Western印跡結果

2.3 熒光共定位分析 將pEGFP-C1-hnRNP A1重組質粒轉染入HeLa細胞，激光共聚焦熒光顯微鏡下可見未處理組中EGFP-hnRNP A1主要分布于細胞核內；當給予0.5 mmol/L亞砷酸鹽氧化應激處理時，EGFP-hnRNP A1與由TAMRA-oligo(dT)30探針標記的poly(A)+mRNA可在胞漿中形成共同的應激顆粒，見圖7，但與內源性的DCP1a加工體顆粒無共定位關系，見圖8。

3 討論

生物體細胞所處環境復雜多變，經常會受到氧化應激、熱休克、紫外線照射、滲透壓休克和病毒感染等各種刺激。為適應這些外界刺激，細胞也已進化出多種應激調節機制，其中最重要的是轉錄后基因調控機制。應激顆粒與加工體便是真核細胞內胞漿中存在的2種與細胞應激mRNA代謝密切相關的顆粒結構[4]。其中，應激顆粒是真核細胞受到環境刺激時產生的顆粒狀結構，由G3BP蛋白、翻譯起始因子eIF4E、RNA結合蛋白TIA-R以及poly(A)+mRNA等組成[4-5]。加工體則是細胞應激時由脫帽行為（decapping）引發的降解mRNA的部位，包括5′→3′核酸外切酶、脫帽酶DCP1a、miRNAs、Argonaute1/2等[4,6]。

研究發現，hnRNP A1蛋白是一種重要RNA結合蛋白，主要存在于細胞核內，可參與選擇性剪接等過程；當細胞受到應激時，在p38信號通路介導下hnRNP A1蛋白會發生高度磷酸化，并穿梭至細胞漿中參與細胞應激顆粒的構成，增強細胞的生存能力[2]。另外，hnRNP A1可與HuR蛋白形成復合物，熱休克刺激會促進該復合物出核并定位于細胞應激顆粒[7]。當細胞受到高滲應激時，eIF2α蛋白發生磷酸化，也會導致hnRNP A1的胞漿分布以及應激顆粒的形成，進而可通過降低Bcl-xL mRNA的轉錄水平來促進凋亡發生[3]。鑒于hnRNP A1蛋白在細胞應激中的重要性，對于該蛋白的有效熒光標記極為重要。EGFP是綠色熒光蛋白（GFP）的一個突變體，其熒光強度及光漂白抗性明顯增強，是迄今為止應用最為廣泛的活體分子標記物之一。本實驗即通過構建pEGFP-C1-hnRNP A1重組質粒的方法對hnRNP A1蛋白進行EGFP熒光標記。EGFP標記的hnRNP A1蛋白在正常生理狀態時主要在胞核中分布，而當細胞受到亞砷酸鹽氧化應激時可與poly(A)+mRNA形成相同的應激顆粒，但與內源性DCP1a加工體顆粒并不存在共定位關系，表明以增強型綠色熒光蛋白標記的hnRNPA1可有效應用于細胞應激方面的研究。

hnRNP A1還與病毒感染、腫瘤、神經性疾病等有關。例如，當細胞感染水皰性口炎病毒時，hnRNP A1蛋白在Rae1蛋白的輔助下會出核并定位于應激顆粒中[8]。hnRNP A1還可能通過細胞應激環節參與肌萎縮側索硬化癥的發生、發展[9-10]。增強型綠色熒光標記的hnRNP A1可用于細胞免疫熒光、活細胞工作站、光漂白恢復、免疫共沉淀等相關實驗，將有助于深入探究hnRNP A1蛋白在細胞應激及相關疾病領域的生物學功能。

Figure 5 The expression of EGFP-hnRNPA1 via confocal fluorescence microscopy(bar=20 μm)圖5 激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察重組質粒的表達(標尺=20 μm)

Figure 7 Cellular co-localization analysis of EGFP-hnRNP A1 and poly(A)+mRNA(bar=10 μm)圖7 EGFP-hnRNP A1與poly(A)+mRNA的細胞內應激共定位分析(標尺=20 μm)

Figure 8 Cellular co-localization analysis of EGFP-hnRNP A1 and DCP1a(bar=20 μm)圖8 EGFP-hnRNP A1與DCP1a的細胞內應激共定位分析(標尺=20 μm)

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（2013-11-14收稿 2014-02-10修回）

（本文編輯 魏杰）

Cellular Localization Analysis of Enhanced Green Fluorescent Protein Tagged hnRNP A1 Under Stress

GAO Xingjie1,SONG Juan2,GE Lin2,FU Xue1,SUN Xiaoming2,ZHANG Wei2,HE Jinyan3,YAO Zhi4,YANG Jie1,2
1 Basic Medical College and Research Center;2 Department of Biochemistry;3 Department of physiology;4 Department of Immunology;Tianjin Medical University,Tianjin,300070,China

ObjectiveTo construct eukaryotic enhanced green fluorescent protein(EGFP)expressing recombinant plasmid,pEGFP-C1-hnRNP A1,which contains coding sequence of human hnRNP A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1),and to perform cellular localization analysis of EGFP tagged hnRNP A1 under stress.MethodsTotal RNA was isolated from HeLa cell used for synthesis of first-strand cDNAs using reverse primers that are specific for the3′-untranslated region of hnRNP A1.hnRNP A1 gene fragments were then amplified by touch-down PCR from those cDNAs and inserted into pEGFP-C1 fluorescent bearing vector through EcoRⅠ/BamHⅡdouble enzyme digestion and T4 DNA Ligase connection.The recombinant pEGFP-C1-hnRNP A1 plasmid was transfected into HeLa cells and green fluorescent tagged fusion proteins was examined by Western blot and confocal fluorescence microscopy.Co-localization of EGFP-hnRNP A1 with poly(A)+mRNA(the marker of the stress granules),or DCP1a(the marker of processome)were detected by RNA fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence.ResultsThe pEGFP-C1-hnRNP A1 was sequenced and digested correctly by restriction single/double enzyme.The green fluorescent fusion protein was also detected in transfected HeLa cell by Western blot and confocal fluorescence microscopy.EGFP-hnRNP A1 co-localizes with poly(A)+mRNA,but not DCP1a.ConclusionRecombinant eukaryotic plasmid of pEGFP-C1-hnRNP A1 was constructed successfully and expressed effectively.EGFP tagged hnRNP A1 takes part in forming stress granules.

heterogeneous-nuclear ribonucleoproteins;green fluorescent proteins;membrane fusion proteins; human hnRNP A1 protein;pEGFP-C1;fusion protein;stress granules

Q591.2,Q784

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.003

*國家自然科學基金資助項目（項目編號：31100967，31170830,31370749）；國家杰出青年基金項目（項目編號：31125012）

1天津醫科大學基礎醫學研究中心（郵編300070），2生化教研室，3生理教研室，4免疫教研室

△通訊作者 E-mail：yangj@tijmu.edu.cn