碳酸飲料對乳恒牙更替期牙齒健康的影響*

孫蓮蓮 李長春 姜忠敏 盛 鳳 李艷霞 劉曉智△

碳酸飲料對乳恒牙更替期牙齒健康的影響*

孫蓮蓮1李長春1姜忠敏2盛 鳳3李艷霞3劉曉智3△

目的 研究碳酸飲料對乳恒牙更替期牙齒健康的影響作用及機制。方法40顆犬牙釉質樣本分別采用15 μL可口可樂（可口可樂組）、雪碧（雪碧組）、純蘇打水（蘇打水組）和生理鹽水（生理鹽水組）浸泡，各10顆。測定處理后飲料中鈣、磷溶出濃度；分離牙乳頭干細胞，以添加可口可樂、雪碧、蘇打水和生理鹽水的條件培養基進行細胞培養，采用PCR法和Western blot法檢測核因子-κB受體活化劑配體（RANKL）、骨保護素（OPG）和維生素D受體（VDR）的mRNA和蛋白表達水平。結果各組鈣、磷溶出濃度（mmol/L）由高到低均依次為：雪碧組（3.679±0.114、0.089±0.008）、可口可樂組（2.217±0.109、0.036±0.005）、生理鹽水組（0.021±0.004、0.009±0.001）和蘇打水組（0.007± 0.001、0.002±0.000）。各組RANKL的mRNA和蛋白表達差異均無統計學意義。蘇打水組和生理鹽水組OPG的mRNA和蛋白表達水平均高于可口可樂組和雪碧組（均P＜0.05），雪碧組與可口可樂組、生理鹽水組與蘇打水組間差異均無統計學意義。生理鹽水組VDR的mRNA和蛋白表達水平低于可口可樂組和雪碧組，高于蘇打水組（均P＜0.05）。結論碳酸飲料可能通過調控成骨相關基因表達及維生素D受體家族共同影響乳恒牙更替期的牙齒健康。

碳酸鹽飲料；RANK配體；骨保護素；受體,骨化三醇；牙乳頭干細胞，維生素D受體

乳恒牙更替期是兒童牙齒生長發育過程中的關鍵階段，但目前人們對這一期間發生的一系列生理變化機制認識有限。探索兒童乳恒牙更替發生發展過程中的內在機制，發現日常飲食中潛在的危險因素，尋找針對性的治療和預防措施至關重要。碳酸飲料因含有糖及酸性成分，長期飲用會使牙齒受到侵蝕，引起“酸蝕癥”。兒童牙齒的牙釉質處于未成熟階段，對抗酸腐蝕的能力較低，pH值在2.2～4.9間的大多數碳酸飲料可導致兒童牙齒的礦質和釉質流失，牙齒齲壞的概率大大增加[1]。本研究以牙乳頭干細胞為對象，通過模擬兒童乳恒牙更替期碳酸飲料對乳恒牙的作用特點，探索其內部可能存在的調控機制，以及碳酸飲料對兒童發育期乳牙脫落及恒牙萌發、生長的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 胎牛血清（杭州四季青），DMEM/F12培養基、胰蛋白酶（美國Invitrogene公司）；可口可樂、雪碧、純蘇打水為市售合格產品；核因子-κB受體活化劑配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）多克隆抗體（美國Chemicon公司），骨保護素（osteoprotegerin，OPG）多克隆抗體及維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。實驗犬牙齒由當地農場提供。

1.2 犬牙釉質樣本的制備 取新鮮拔除的犬下頜切牙48顆，去除牙根及牙髓組織，用無氟石英粉磨去釉質表面菌斑及色素，流水沖洗干凈。經體視顯微鏡檢查無裂痕、缺隙者共40顆，置于去離子水中，于-20℃冰箱中保存、備用。

1.3 飲料處理牙釉質后鈣、磷濃度的測定 采用完全隨機法將40顆犬牙分為可口可樂組、雪碧組、蘇打水組和生理鹽水組，各10顆。用0.5 mol/L的過氯酸酸蝕暴露的釉質面30 s，分別取15 μL可口可樂、雪碧、純蘇打水和生理鹽水滴加于釉質面，于37℃處理牙釉質，5次/d，5 min/次，處理后的飲料收集于EP管中。處理間隙置于生理鹽水中過夜。7 d后將收集的同一種飲料混合。每10 μL飲料加入280 μL的鈣、磷反應液，振蕩混勻后立即于自動微板讀數儀，于630 nm處測定鈣和磷的吸光度值（A），同期做標準曲線，計算鈣、磷溶出濃度C濃度=（A-1.648）/137.36。

1.4 牙乳頭干細胞的分離與培養 將來自犬上下頜的第二磨牙牙胚置于培養液中，完整分離牙乳頭和成釉器，參照文獻[2]進行乳頭干細胞的分離與培養。

1.5 牙乳頭干細胞在條件培養液中的培養 以可口可樂、雪碧、蘇打水和生理鹽水為添加劑，配制條件培養液進行牙乳頭干細胞的培養。其他細胞培養方式同1.4。

1.6 聚合酶鏈式反應（PCR） 提取細胞總RNA，反轉錄酶轉錄后進行PCR循環反應。利用引物設計軟件設計合成上游引物和下游引物序列。β-actin作為內參對照。反應條件：94℃預變性5 min，94℃45 s，60℃60 s，72℃90 s，30個循環，72℃延伸10 min。取15 μL反應物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀測并記錄反應結果。RANKL上游引物：5′-GAGACTACGGCAAGTA-3′；下游引物：5′-CCTCCAACGTTTATGG-3′，擴增產物長度為822 bp。OPG上游引物：5′-TGGAGCTCGAATTCTGCTTG-3′；下游引物：5′-CATCAAGATGCGGAGC TGCT-3′，引物擴增產物長度為603 bp。VDR上游引物：5′-ACCCCCACTGAAAAAGATA-3′；下游引物：5′-CCGTGAATTCGCACCGCACAG-3′，擴增片段為306 bp。βactin上游引物：5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′；下游引物：5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGCA-3′，引物擴增產物長度為410 bp。

1.7 Western blot實驗 參照文獻[2]，采用Western blot檢測RANKL、OPG和VDR的蛋白表達水平。

1.8 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統計處理，計量資料數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同碳酸飲料處理牙釉質對鈣、磷溶出濃度的影響 各組鈣、磷溶出濃度由高到低均依次為：雪碧組、可口可樂組、生理鹽水組和蘇打水組；組間多重比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

Table 1 Comparison of dissolution concentration of calcium and scale between all groups表1 各組鈣、磷溶出濃度比較（mmol/L，n=10，±s）

Table 1 Comparison of dissolution concentration of calcium and scale between all groups表1 各組鈣、磷溶出濃度比較（mmol/L，n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與可口可樂組比較，b與雪碧組比較，c與蘇打水組比較，P＜0.05

組別可口可樂組雪碧組蘇打水組生理鹽水組F鈣磷2.217±0.109 3.679±0.114a0.007±0.001ab0.021±0.004abc21.835＊＊0.036±0.005 0.089±0.008a0.002±0.000ab0.009±0.001abc15.664＊＊

2.2 碳酸飲料對RANKL、OPG和VDR mRNA表達的影響 各組RANKL mRNA的表達差異無統計學意義。蘇打水組和生理鹽水組OPG mRNA表達水平均高于可口可樂組和雪碧組（均P＜0.05），雪碧組與可口可樂組、生理鹽水組與蘇打水組間差異均無統計學意義。生理鹽水組VDR mRNA表達水平低于可口可樂組和雪碧組，高于蘇打水組（均P＜0.05），雪碧組與可口可樂組間差異無統計學意義，見圖1。

2.3 碳酸飲料對RANKL、OPG和VDR蛋白表達的影響 各組RANKL蛋白的表達差異無統計學意義。蘇打水組和生理鹽水組OPG蛋白質表達水平均高于可口可樂組和雪碧組（均P＜0.05），雪碧組與可口可樂組、生理鹽水組與蘇打水組間差異均無統計學意義。生理鹽水組VDR蛋白表達水平低于可口可樂組和雪碧組，高于蘇打水組（均P＜0.05），雪碧組與可口可樂組間差異無統計學意義，見圖2。

3 討論

成骨細胞和破骨細胞在骨科領域被廣泛研究，二者間的動態平衡影響兒童骨骼發育以及成人病理狀態下的骨吸收與增殖異常[3]。RANKL又稱為骨保護素配體及破骨細胞分化因子，在骨骼中的主要作用為刺激破骨細胞的分化和活性，抑制破骨細胞的凋亡。RANKL過表達可導致一系列骨疾病，如風濕性關節炎、銀屑病性關節炎等[4]。OPG的主要作用是抑制破骨細胞的形成和活性，OPG治療可預防骨質疏松和血管鈣化及逆轉骨質疏松[5]。乳恒牙更替是兒童牙齒生長發育的一個重要階段，此階段乳牙牙髓、牙周膜、牙槽骨以及繼承恒牙胚等組織內均發生一系列變化，并需要有分化成熟的破骨細胞吸收乳牙根、牙槽骨等組織，為恒牙胚的發育和萌出開辟空間，使得乳恒牙實現順利替換。基于以上理論，本研究以犬乳恒牙更替期飲用碳酸飲料的作用特點，研究破骨及成骨相關基因RANKL和OPG的表達變化，探索在上述基因間可能存在的網絡調控機制，以及碳酸飲料可能在兒童發育期對乳牙脫落及恒牙萌發、生長的影響。

Figure 1 Effect of the carbonated drinks on mRNA、transcription of some genes圖1各組RANKL、OPG和VDR的mRNA表達比較

Figure 2 Effect of the carbonated drinks on some protein expression圖2 各組RANKL、OPG和VDR蛋白表達比較

可口可樂和雪碧為酸性飲料，純蘇打水為堿性溶液[6]。本研究結果顯示，可口可樂組和雪碧組鈣、磷溶出濃度均高于生理鹽水組，蘇打水組鈣、磷溶出濃度低于生理鹽水組，提示酸性碳酸飲料具有明顯的脫鈣與脫磷作用；而堿性飲料則表現出一定的鈣、磷保護作用，可在一定程度上抑制上述反應。由于雪碧的pH值高于可口可樂[7]，但其脫鈣與脫磷作用最為明顯，提示酸堿度不是影響脫鈣與脫磷作用的唯一因素。為進一步探索其可能存在的分子機制，本研究通過分離牙乳頭干細胞，以添加3種飲料的條件培養基進行細胞培養，結果發現，3種飲料對RANKL基因的mRNA和蛋白水平均無影響；可口可樂和雪碧可降低OPG的表達水平，但純蘇打水對OPG基因的表達無明顯影響。提示日常飲用的碳酸飲料幾乎不會影響牙乳頭干細胞中RANKL的功能，但酸性飲料可降低OPG的表達，進而影響成骨細胞與破骨細胞間的動態平衡。

由于在上述結果僅發現碳酸飲料可影響OPG的表達，但作用較輕微，筆者推測碳酸飲料可能通過其他機制共同影響兒童乳恒牙更替期的牙乳頭干細胞的生長。因此本研究選擇對鈣、磷調節起重要作用的VDR為研究對象進行實驗，結果表明可口可樂和雪碧可同時升高VDR基因的表達，純蘇打水則可明顯降低VDR基因的表達水平。提示VDR可能在此調控過程中發揮了更為積極的作用，但其具體機制有待于進一步研究。

綜上所述，碳酸飲料可能通過調控成骨相關基因表達及維生素D受體家族共同影響兒童乳恒牙更替期的牙齒健康。

[1]Liu H,Cao T.Dental application potential of mesenchymal stromal cells and embryonic stem cells[J].Chin J Dent Res,2010,13(2):95-103.

[2]李長春，孫蓮蓮，姜忠敏，等.1,25（OH）2D3在牙乳頭干細胞成骨分化中的作用[J].天津醫藥，2014，42（5）：421-423.

[3]王曉春,于海燕,畢佳銳,等.基質金屬蛋白酶在健康牙齒和齲齒成牙本質細胞中的表達[J].天津醫藥,2013,41(1):12-14.

[4]穆玉,陳乃玲,彭偉,等.羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對小鼠L929細胞增殖的影響[J].天津醫藥,2012,40(4):363-365,421.

[5]Petrovic V,Stefanovic V.Dental tissue-new source for stem cells [J].Scientific World Journal.2009,9:1167-1177.doi:10.1100/ tsw.2009.125.

[6]Ruparel NB,Teixeira FB,Ferraz CC,et al.Direct effect of intracanal medicaments on survival of stem cells of the apical papilla[J].J Endod,2012,38(10):1372-1375.doi:10.1016/j.joen.2012.06.018.

[7]Sedgley CM,Botero TM.Dental stem cells and their sources[J]. DentClin North Am,2012,56(3):549-561.doi:10.1016/j. cden.2012.05.004.

（2013-09-01收稿 2013-12-20修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effect of Carbonated Drinks on Primary and Permanent Teeth Replacement in Children

SUN Lianlian1,LI Changchun1,JIANG Zhongmin2,SHENG Feng3,LI Yanxia3,LIU Xiaozhi3
1 Department of Stomatology,2 Department of Pathology,3 the Central Laboratory，the Fifth Central Hospital of Tianjin, Tianjin 300450,China

ObjectiveTo study the effect of carbonated drinks on primary and permanent teeth replacement in Children.Method Dog tooth enamel samples were soaked in coca-cola,sprite and pure soda,and the calcium,phosphorus level were analysed.Dental papilla stem cells were separated and cultured in the conditioned medium by adding three drinks. PCR and western blot were used to detect mRNA and protein levels of activator of nuclear factor-k B receptor ligand (RANKL),osteoprotegerin(OPG)and vitamin D receptor(VDR),then the possible role of each gene and interactions relationship were analyzed.ResultsCompared with saline,coca-cola and sprite showed their significantly decalcification and dephosphorization role,while plain soda water showed calcium and phosphorus protective effect.These three drinks had no effect on mRNA and protein levels of RANKL gene(P＞0.05).Coca-cola and sprite can reduce OPG mRNA and protein levels,and at the same time increase transcription and expression of the VDR gene.Plain soda water has no effect on the OPG gene manifestation,but can significantly reduce the transcription and translation level of the VDR gene.ConclusionCarbonated drinks may affect the dental health of the children's primary and permanent teeth replacement by regulating bone related gene expression and vitamin D receptor family.

carbonated beverages;RANK ligand;osteoprotegerin;receptors,calcitriol;dental papilla stem cells;vitamin D receptor

R788

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.015

*天津市衛生局科技基金項目（項目編號：2011KZ25）

1天津市第五中心醫院口腔科(郵編300450),2病理科, 3中心實驗室

△通訊作者 E-mail：lxz7997@126.com