HBV感染的肝癌患者外周血中調節性T細胞的水平分析*

劉 輝 李建宇 王鳳梅 王 鵬 李成龍 駱 瑩 朱爭艷△

HBV感染的肝癌患者外周血中調節性T細胞的水平分析*

劉 輝1李建宇2王鳳梅1王 鵬1李成龍1駱 瑩1朱爭艷1△

目的 檢測乙肝病毒(HBV)感染的肝癌患者外周血中CD4+CD25+CD127low調節性T細胞(Tregs)的水平，分析其與HBV感染的相關性。方法采集41例感染HBV的肝癌患者（HBV+組）、34例未感染HBV的肝癌患者（HBV-組）及29例正常健康受試者（對照組）的外周抗凝血，利用流式細胞術檢測各組受試者外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs水平，通過熒光定量聚合酶鏈反應檢測感染HBV的肝癌患者血清中HBV DNA載量，分析Tregs水平與HBV DNA載量的相關性。結果HBV+組外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs占CD4+T細胞的比率顯著高于HBV-組和對照組[(8.24±2.20)%vs(7.06±2.46)%vs(6.51±1.99)%,P＜0.05]，HBV-組高于對照組；CD4+CD25+CD127lowTregs水平與HBV DNA載量(取對數轉換)呈正相關(r=0.350，P＜0.05)。結論肝癌患者外周血中Tregs的水平異常增高，且與HBV DNA復制密切相關，這可能是肝癌細胞免疫逃逸的重要原因。

肝腫瘤；肝炎，乙型；T淋巴細胞,調節性；免疫功能；CD127

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，乙肝病毒(HBV)感染是肝癌發病的主要原因，許多肝癌患者體內都可檢測到HBV DNA的復制[1]。研究發現，HBV DNA具有4個開放的閱讀框，其中X基因編碼蛋白可誘導肝細胞的癌變及惡性進展[2]。目前，針對肝癌的傳統治療效果均不甚理想，免疫治療正逐漸成為肝癌臨床治療的一種輔助或替代療法。調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是具有免疫調節功能的細胞亞群，在免疫應答的負調節及自身免疫耐受中發揮重要作用[3]。研究發現，多種腫瘤患者體內Tregs水平異常升高，提示Tregs對免疫應答的抑制作用可能促進了腫瘤的發生發展[4]。本課題前期研究發現，Tregs水平的變化可以準確反映肝癌的惡性程度與進展水平[5]，但關于Tregs水平與HBV DNA復制的相關性還未完全闡明。本研究通過檢測HBV感染的肝癌患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs的水平，分析其水平差異與HBV DNA載量變化的相關性，探討肝癌發生發展中的免疫逃逸機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6月—2013年6月入住我院肝內科的75例原發性肝癌患者，診斷參照第四屆全國肝癌學術會議制定的《原發性肝癌臨床診斷標準》，其中41例感染HBV(HBV+組)，34例未感染HBV(HBV-組)，所有患者均排除藥物、乙醇及其他肝炎病毒感染等原因造成的肝臟損害，且在半年內未經免疫抑制劑及抗病毒治療。另選取正常健康受試者29例為對照組，經查體，血尿常規、心電圖、胸片、腹部B超及肝腎功能、肝病自身抗體均無異常。

1.2 試劑及儀器 鼠抗人單克隆抗體：anti-CD4-FITC抗體、anti-CD25-PECY5抗體、anti-CD127-PE抗體及各自的同型對照(美國Beckman公司)；HBV DNA定量檢測試劑盒(北京達安基因有限公司)；Epics Altra流式細胞儀(美國Beckman公司)，KDC-1042離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，ViiATM7熒光定量PCR儀(美國Life公司)，CHA-S恒溫振蕩器(江蘇金城國勝實驗儀器廠)。

1.3 CD4+CD25+CD127lowTregs水平的檢測 采集受試者外周靜脈血，加入EDTA進行抗凝處理，利用CD4、CD25、CD127三抗原標記法檢測Tregs水平。具體操作如下：每個樣品分設檢測管和對照管。檢測管內依次加入CD4-FITC抗體、CD25-PECY5抗體及CD127-PE抗體各10 μL，對照管內依次加入CD4-FITC抗體、CD25同型對照-PECY5抗體及CD127同型對照-PE抗體各10 μL，而后分別向檢測管和對照管內加入受試者的抗凝外周血100 μL，混勻，避光孵育30 min，加入4.5 mL溶血素溶血，37℃避光振蕩10 min，1 600 r/min離心5 min，棄上清，加入1%多聚甲醛固定后，上流式細胞儀進行檢測。利用Expo32軟件進行數據處理，分析CD4+CD25+CD127lowTregs細胞占CD4+T細胞的百分率。

1.4 HBV DNA載量的測定 采用熒光定量PCR法檢測感染HBV的肝癌患者血清中HBV DNA載量，具體操作按照試劑盒說明書進行。根據標準曲線得出目的基因DNA的分子拷貝數，并將DNA拷貝數經對數轉換后用于統計學分析。

1.5 統計學方法 數據采用SPSS 13.0進行統計處理，結果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間多重比較采用LSD-t檢驗，相關分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs的檢測水平比較 HBV+組的CD4+CD25+CD127lowTregs水平高于HBV-組和對照組，HBV-組高于對照組(P＜0.05)，見圖1、表1。

Figure 1 CD4+CD25+CD127lowTregs level in different groups圖1 各組受試者CD4+CD25+CD127lowTregs水平比較

Table 1 The CD4+CD25+CD127lowTregs level in different groups表1 各組外周血CD4+CD25+CD127lowTregs水平比較（±s）

Table 1 The CD4+CD25+CD127lowTregs level in different groups表1 各組外周血CD4+CD25+CD127lowTregs水平比較（±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與HBV-組比較，P＜0.05

組別對照組HBV-組HBV+組F n 29 34 41 CD4+CD25+CD127low/CD4+(%) 6.51±1.99 7.06±2.46a8.24±2.20ab7.397＊

2.2 HBV+肝癌患者CD4+CD25+CD127lowTregs水平與HBV DNA載量的相關性 HBV+肝癌患者的CD4+CD25+CD127lowTregs水平與HBV DNA載量(經對數轉換為4.59±1.36)呈正相關(r=0.350，P＜0.05)。

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其惡性度高，易發生侵襲和轉移[6]，我國肝癌發病人數占全球肝癌患者的55%[7]。目前，針對肝癌的傳統治療效果均不甚理想，其中手術切除率較低，而全身化療和放療方法，因腫瘤反應率低、不良反應大，已淡出肝癌的主流治療[8]。因此，探索有效的免疫治療途徑，對降低肝癌患者的病死率將具有重要意義。

Tregs是一類在腫瘤免疫應答的負調節中發揮重要作用的細胞亞群。研究發現，多種腫瘤患者體內Tregs水平異常增高，降低Tregs水平或阻斷其活性可提高腫瘤免疫治療的有效性[4]。目前關于Tregs在肝癌發生發展中的作用還不明確，研究結果不一致[9]，這主要是由于流式檢測中抗體的標記手段不同所致[10]。傳統的方法主要是通過CD25標記Tregs水平，但CD25陽性的Tregs在很大程度上與CD4陽性的T細胞相重疊，影響了Tregs的準確檢出。因此，尋找Tregs的特異性標記物是近年來的研究熱點。CD127(白細胞介素-7受體，IL-7R)是最新發現的一種與Tregs密切相關的表面抗原，可作為識別Tregs的理想標記物[11]。研究發現，利用CD4+CD25+CD127low標記的T細胞具備了Tregs的典型特征，通過該方法可深入探討Tregs的免疫功能及各類腫瘤的發病機制[12]。本研究前期通過流式細胞術對肝癌患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs水平進行了檢測，發現Tregs水平的變化可以準確反映肝癌的惡性程度與進展水平[5]，但關于不同肝癌患者體內Tregs水平變化的調控機制還不清楚。

HBV感染被認為是肝癌發病的主要原因，不同肝癌患者體內Tregs水平的差異可能與HBV感染及其DNA復制有關。本實驗發現不同肝癌患者體內的Tregs水平均顯著高于健康受試者體內的Tregs水平，與前期研究結果一致，進一步證實了Tregs在肝癌發生發展中的促進作用。另外，感染HBV的肝癌患者體內Tregs水平顯著高于未感染HBV的肝癌患者體內Tregs水平，提示HBV可能參與了肝癌患者體內Tregs水平的調控。本研究還發現肝癌患者體內的Tregs水平隨HBV DNA載量的增高而逐漸升高，兩者呈正相關，提示肝癌患者體內HBV的復制可能促進了Tregs水平的上調。

綜上，肝癌患者體內CD4+CD25+CD127lowTregs的水平異常增高，且HBV DNA的復制可能促進了Tregs的免疫抑制效應，這可能是肝癌細胞免疫逃逸的重要原因。

[1]黃飛,陸玲玲,倪正平.肝癌患者乙肝病毒血清學標志物模式與HBV-DNA相關性研究[J].中國中醫藥現代遠程教育,2012,10 (19):83-84.

[2]李衛華,陳廣原,余湘文,等.乙型肝炎病毒X蛋白對人肝癌細胞hsp90a基因表達調控機制研究[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20 (20):1574-1579.

[3]趙娜娜,趙婷婷,刑艷,等.肝細胞性肝癌腫瘤浸潤調節性T細胞的表型分析和功能探討[J].免疫學雜志,2013,29(2):115-120.

[4]盧永剛,劉凌云,何沙.CD4+CD25+調節性T細胞與腫瘤免疫的研究進展[J].中國現代普通外科進展,2014,16(2):134-137.

[5]劉輝,朱爭艷,王鵬,等.原發性肝癌患者CD4+CD25+CD127low調節性T細胞的檢測及意義[J].中國腫瘤臨床,2011,38(22):1373-1376.

[6]孫靜云,徐吉敏,嚴明,等.骨橋蛋白與肝癌轉移復發關系的研究進展[J].世界華人消化雜志,2013,21(16):1498-1504.

[7]EI-Serag HB,Rudolph KL.Hepatocellular carcinoma:epidemiology and molecular carcinogenesis[J].Gastroenterology,2007,132 (7):2557-2576.

[8] Fornaro L,Vivaldi C,Caparello C,et al.Dissecting signaling pathways in hepatocellular carcinoma:new perspectives in medical therapy[J].Future Oncol,2014,10(2):285-304.

[9]Fu J,Xu D,Liu Z,et al.Increased regulatory T cells correlate with CD8 T-cell impairment and poor survival in hepatocellular carcinoma patients[J].Gastroenterology,2007,132(7):2328-2339.

[10]Unitt E,Rushbrook SM,Marshall A,et al.Compromised lymphocytes infiltrate hepatocellular carcinoma:the role of T-regulatory cells[J].Hepatology,2005,41(4):722-730.

[11]Li JG,Zhuan-sun YX,Wen B,et al.Human mesenchymal stem cells elevate CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells of asthmatic patients via heme oxygenase-1[J].Iran J Allergy Asthma Immunol, 2013,12(3):228-235.

[12]汪萍,奚迪,王維維,等.CD4+CD25+CD127low/-調節性T細胞異常表達與多發性骨髓瘤的關聯性分析[J].國際檢驗醫學雜志,2012,33 (7):796-799.

（2013-12-17收稿 2012-02-01修回）

（本文編輯 閆娟）

Analysis of CD4+CD25+CD127lowRegulatory T Cells in Peripheral Blood of Hepatocellular Carcinoma Patients with HBV Infection

LIU Hui1,LI Jianyu2,WANG Fengmei1,WANG Peng1,LI Chenglong1,LUO Ying1,ZHU Zhengyan1
1 Institute of Hepatobiliary Disease,Tianjin Third Central Hospital,Tianjin Key Laboratory of Artificial Cell,Tianjin 300170, China；2 Department of Chemical Pharmacy,Logistics College of Chinese People’s Armed Police Forces

ObjectiveTo investigate the level of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells(Tregs)in the peripheral blood of hepatocellular carcinoma(HCC)patients with HBV infection and to explore the relationship between these cells and HBV infection.MethodsPeripheral blood mononuclear cells were isolated from 41 HCC patients infected with HBV,34 HCC patients without HBV infection and 29 healthy persons.These mononuclear cells were labeled with the monoclonal antibodies of CD4,CD25 and CD127,and then Tregs level was determined by flow cytometry(FCM).Moreover,the load of HBV DNA in the blood serum of HCC patients with HBV infection was detected by fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).ResultsThe percentage of CD4+CD25+CD127lowTregs in CD4+T cells in the HCC patients with HBV infection was higher than that in the HCC patients without HBV infection[(8.24±2.20)%vs(7.06±2.46)%,P＜0.05]and that in the healthy persons[(8.24±2.20)%vs(6.51±1.99)%,P＜0.01].Furthermore,the percentage of CD4+CD25+CD127lowTregs in CD4+T cells in the HCC patients without HBV infection was higher than that in the healthy persons[(7.06±2.46)%vs(6.51± 1.99)%,P＜0.05].In addition,the level of CD4+CD25+CD127lowTregs in the HCC patients with HBV infection was gradually increased following the increase of HBV DNA load and there was a positive correlation between the level of CD4+CD25+CD127lowTregs and the load of HBV DNA(r=0.350，P＜0.05).ConclusionThe level of CD4+CD25+CD127lowTregs in HCC patients is increased remarkably and associated with the number of HBV DNA copy,which may be an important mechanism of immunologic escape of virus in HCC.

liver neoplasms;hepatitis B;T-lymphocytes,regulatory;immunologic function;CD127

R392.1，R735.7

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.005

*天津市科委面上項目(編號：13JCYBJC22500)；天津市衛生局科技基金(項目編號：2010KY03)；天津市高新技術產業化專項資金(項目編號：津發改高技[2006]26號)

1天津市第三中心醫院肝膽疾病研究所，天津市人工細胞重點實驗室（郵編300170）；2武警后勤學院藥物化學教研室

△通訊作者 E-mail：Zhuzhengyan59@163.com