膠質瘤組織中TSSC1的表達及其對膠質瘤U87細胞生物學行為的影響

劉義賓 馬云富 陳建設 王銀輝

膠質瘤組織中TSSC1的表達及其對膠質瘤U87細胞生物學行為的影響

劉義賓 馬云富△陳建設 王銀輝

目的 研究腫瘤抑制可轉移候選基因1(TSSC1)在膠質瘤組織中的表達及其對膠質瘤U87細胞生物學行為的影響。方法采用Real time-PCR和Western blot檢測80例膠質瘤（Ⅰ期25例，Ⅱ期32例，Ⅲ期15例，Ⅳ期8例）組織和瘤旁組織中TSSC1的表達，采用化學合成的針對TSSC1基因的2個小干擾RNA(siRNA-TSSC1-1和siRNATSSC1-2)下調該基因的表達，通過MTT和Transwell法分別檢測TSSC1對U87細胞增殖、遷移和侵襲的影響。結果TSSC1在膠質瘤組織中的表達低于相應的瘤旁組織，同時在臨床分期Ⅲ期、Ⅳ期中較Ⅰ期表達降低，將siRNATSSC1-1和siRNA-TSSC1-2轉染入U87細胞后，U87細胞中TSSC1 mRNA和蛋白表達水平都明顯降低，細胞增殖能力顯著增強，細胞的遷移和侵襲能力顯著增強。結論TSSC1有望成為膠質瘤早期診斷和預測預后的生物分子標志物。

神經膠質瘤；RNA,小分子干擾;腫瘤抑制可轉移候選基因1;U87細胞

膠質瘤發病率約占腦腫瘤的50%左右，是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，具有侵襲性生長、無控性增殖、易復發的特點[1-2]。其本質上是一種多基因異常疾病，由于原癌基因的過表達，同時伴隨抑癌基因的突變缺失，從而使腫瘤細胞逃避了正常生長的調控機制。傳統治療方法（包括手術、化療和放療）并沒有完全解決膠質瘤侵襲性生長所導致的高復發率和低治愈率難題。針對與膠質瘤發生、發展相關的基因異常的治療已成為研究熱點[3]。腫瘤抑制可轉移候選基因1（TSSC1）是一個新發現的腫瘤基因，可能在多種腫瘤的發生發展中起重要作用[4]。 Shore等[5]研究表明，TSSC1可抑制乳腺癌骨轉移。Wang等[6]研究發現，TSSC1能轉錄調節RUNX2啟動子的活性，從而抑制乳腺癌骨轉移。但有關TSSC1在膠質瘤惡性腫瘤中的表達及其與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲的關系尚鮮見報道。本研究通過檢測膠質瘤原發組織和瘤旁組織中TSSC1的表達，觀察TSSC1的表達對膠質瘤細胞系U87生物學行為的影響，為深入研究膠質瘤的分子病理機制及臨床治療提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 U87惡性膠質瘤細胞系購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。80例膠質瘤組織標本及對應瘤旁組織取自2001年6月—2009年10月我院收治的膠質瘤患者，按照WHO標準(2008年修改版)將膠質瘤標本分級，所有標本經病理證實，其中Ⅰ期25例，Ⅱ期32例，Ⅲ期15例，Ⅳ期8例。組織樣本經液氮速凍后-80℃保存。所有樣本采集和使用均征得患者同意并簽署知情同意書后由我院倫理委員會同意。

1.2 Real time-PCR檢測TSSC1 mRNA的表達 采用TRIZOL一步法快速提取細胞及組織總RNA。取2 μg總RNA于37℃在逆轉錄酶、RNA酶抑制劑作用下進行反轉錄合成cDNA，cDNA的合成體系參照文獻[7]。引物及探針均由上海生工生物工程公司合成。20 μL反應體系中包括由40 ng總RNA反轉錄所得的cDNA，10 μL Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG，10 μmol/L的上下游引物和TaqMan探針各0.4 μL。PCR反應條件為50℃溫育2 min，95℃預變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火延伸1 min，40個循環。CT值為熒光信號達到設定閾值時所經過的循環數。每個樣本中每個基因的檢測均重復3次。△CT值為各樣本中目的基因的CT值與管家基因GAPDH的CT值之差，2-△CT則為該樣本中TSSC1相對于GAPDH的mRNA表達量。

1.3 Western blot檢測細胞及組織中TSSC1蛋白的表達 制備4%濃縮膠和10%分離膠的聚丙烯酰胺垂直平板凝膠，40 μg總蛋白經80 V電壓電泳3 h后，電轉70 V 3 h轉印至PVDF膜。含5%ECL化學發光試劑盒的TBS-T（pH 8.3）室溫封閉1 h后加入鼠抗人TSSC1一抗，以β-actin為內參。4℃平搖過夜，TBS-T洗膜6次后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜6次，加ECL Western blot檢測試劑顯色1～2 min，曝光X線膠片。

1.4 siRNA轉染 針對TSSC1基因的2個小干擾RNA(siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2)購自上海吉瑪公司，陰性對照(siRNA）由上海吉瑪公司贈送。實驗分為（1）空白對照組：無處理的U87細胞。（2）陰性對照組：轉染siRNA。（3）實驗組1：轉染siRNA-TSSC1-1。（4）實驗組2：轉染siRNA-TSSC1-2。U87細胞培養于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養基（Invitrogen公司），培養基加入100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素，于37℃、5%CO2培養至對數生長期或80%飽和度。接種2×105個細胞/孔于6孔板，以無抗生素的含血清培養基培養。100 nmol/L siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2分別和2 μL Lipofectamine 2000各溶于50 μL培養基，孵育5 min后混合20 min，緩慢滴入置于500 μL OPTI-DMEM無血清培養基的細胞中，6 h后將培養液更換為含血清的RPMI-1640培養液培養。轉染48 h后用于基因表達檢測、蛋白表達和細胞生物學行為實驗。

1.5 MTT檢測轉染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2后細胞增殖能力 U87細胞分別轉染脂質體、siControl、siRNATSSC1-1、siRNA-TSSC1-2，48 h后，胰酶消化對數期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數調整至1 000～10 000個細胞/孔。5%CO2、37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，設3個復孔,于24、48、72 h后每孔加入10 mL MTT溶液（5 g/L），繼續培養4 h，小心用PBS沖2～3遍后。每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀于570 nm處測量各孔的吸光度（A）值。

1.6 Transwell檢測轉染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2后細胞的遷移和侵襲能力 將懸浮于500 μL無血清培養基的5×104個siControl、siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2細胞分別接種于含Metrigel和不含Metrigel的transwell上室，下層加入750 μL含10%FBS的細胞培養液，培養8 h。取出transwell小室，用棉簽拭去上層未穿過的細胞，蘇木素染色后封片，于鏡下觀察穿孔細胞數目。

1.7 統計學方法 用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（±s）表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSSC1在膠質瘤組織和正常腦組織表達水平比較 TSSC1在膠質瘤組織較瘤旁正常腦組織中表達下調，見圖1、2。

Figure 1 TSSC1 mRNA transcription level in glioma tissue(T) and paraneoplastic normal brain tissue(N)圖1 膠質瘤組織及瘤旁正常組織中TSSC1 mRNA表達水平

Figure 2 TSSC1 protein expression levels in glioma tissue(T)and paraneoplastic normal brain tissue(N)圖2 膠質瘤組織及瘤旁正常組織TSSC1蛋白表達水平

2.2 TSSC1表達與臨床分期的關系 TSSC1在Ⅰ期中表達水平較高，Ⅲ期、Ⅳ期中表達水平明顯降低，見圖3、4。

Figure 3 Real time-PCR analysis of TSSC1 mRNA transcription levels in glioma of different grade圖3 不同臨床分期膠質瘤組織中TSSC1 mRNA表達比較

Figure 4 Western blot anlaysis of TSSC1 protein expression levels in glioma of different grade圖4 不同臨床分期膠質瘤組織中TSSC1蛋白表達水平

2.3 轉染效率的鑒定 實驗組1和實驗組2中TSSC1 mRNA和蛋白表達水平較空白對照組和陰性對照組降低，見圖5、6。

Figure 5 Real time-PCR analysis of TSSC1 mRNA transcription level in TSSC1 siRNAs-transfected and control U87 cells圖5 轉染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2后TSSC1 mRNA表達水平

Figure 6 Western blot analysis of the TSSC1 protein expression in TSSC1 siRNAs-transfected and control U87 cells圖6 轉染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2后TSSC1蛋白表達水平

2.4 沉默TSSC1對細胞增殖的影響 培養1～5 d時，各組細胞增殖率差異無統計學意義，培養7、9 d時，實驗組細胞增殖能力較對照組顯著增強（P＜0.01），見表1。

Table 1 Depletion of TSSC1 promotes U87 cell proliferation shown by MTT assay表1 MTT檢測各組吸光度 （n=5，A570±s）

Table 1 Depletion of TSSC1 promotes U87 cell proliferation shown by MTT assay表1 MTT檢測各組吸光度 （n=5，A570±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，P＜0.01

組別空白對照組陰性對照組實驗組1實驗組2 F 1 d 0.26±0.07 0.25±0.05 0.25±0.08 0.24±0.05 2.500 3 d 0.45±0.09 0.47±0.10 0.52±0.11 0.48±0.15 3.146 5 d 1.19±0.12 1.21±0.14 1.38±0.21 1.46±0.27 3.145 7 d 2.00±0.29 2.11±0.30 2.70±0.34a2.66±0.41a18.105＊＊9 d 2.58±0.32 2.55±0.26 3.30±0.41a3.25±0.39a21.778＊＊

2.5 沉默TSSC1對細胞遷移和侵襲能力的影響 轉染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2組細胞的遷移能力高于對照組（F=22.447，P＜0.01），見圖7。轉染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2組細胞的侵襲能力也高于對照組（F=25.671，P＜0.01），見圖8。

Figure 7 Transwell analysis of the cell migration ability圖7 Transwell檢測各組遷移能力的改變

Figure 8 Transwell analysis of the cell invasion ability圖8 Transwell檢測各組侵襲能力的改變

3 討論

膠質瘤患者預后極差，傳統的治療方法，包括手術、放療和化療不能顯著改善患者生存。近年來，隨著腫瘤分子生物學技術的發展和對腫瘤發病機制的認識不斷加深，針對某些關鍵基因的分子靶向治療或導入某些抑癌基因成為腫瘤治療的熱點。

TSSC1是近年來新發現的一個腫瘤抑制基因，其基因定位于11q15.5上，編碼1.7 ku的蛋白，是癌相關成纖維蛋白，在正常組織中高表達,是腫瘤抑制基因[8]。本研究發現TSSC1在膠質瘤原發組織中的表達量低于瘤旁正常腦組織，且在臨床分期Ⅲ期、Ⅳ期中較Ⅰ期表達降低，這與Cai等[9]研究報道TSSC1在乳腺癌組織和發生骨轉移的組織中低表達，抑制乳腺癌骨轉移結果一致，提示其是一個潛在的分子標志物，可作為臨床分期的輔助指標。但TSSC1與患者預后及放化療敏感性的關系還有待進一步研究。

最新研究表明，在乳腺癌嗜骨轉移性細胞系MDA-MB-231中TSSC1 mRNA和蛋白均較正常乳腺細胞低表達，并能抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為，提示其是一個潛在的抑癌基因[6]。同時，Runx2能結合于TSSC1啟動子區并轉錄，抑制TSSC1啟動子活性，從而促進乳腺癌細胞發生骨轉移[6]，TSSC1抑制乳腺癌細胞發生骨轉移。本研究通過RNA干擾技術沉默膠質瘤細胞U87中TSSC1的表達，發現其能顯著促進膠質瘤細胞的增殖、運動和侵襲等生物學行為。因此筆者推測TSSC1可能參與腫瘤血管生成，在多種腫瘤的發生發展中起著重要作用。

綜上，TSSC1在膠質瘤中發揮抑癌基因的作用，其在膠質瘤中具有較高的診斷價值，可能作為腦膠質瘤基因治療的候選基因，但能否作為膠質瘤治療的靶基因，及其內在分子生物學機制有待進一步研究。

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（2013-10-18收稿 2014-01-21修回）

（本文編輯 閆娟）

Expression of TSSC1 in Glioma Tissue and Its Effect on Cell Biological Behavier of Glioma U87 Cells

LIU Yibin,MA Yunfu,CHEN Jianshe,WANG Yinhui
Department of Neurosurgery,the fourth Affiliated Hospital of Zhengzhou University

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of TSSC1 in glioma patients and its influence on cell biological behavior of glioma U87 cells.MethodsRT-PCR and Western blot were used to examine the expression of TSSC1 in glioma samples,including 80 normal paraneoplastic tissues and 80 primary tumors.MTT and transwell were used to analyze the effect of TSSC1 knockout on proliferation,migration,and invasion in U87 cells.ResultsTSSC1 is down-regulated in glioma compared to its paraneoplastic counterparts and negatively related to higher grade.Furthermore,knockdown of TSSC1 expression results in increased proliferation,migration and invasion in U87 cells in vitro.ConclusionOur results may worked as a marker for early diagnosis and prognosis of glioma.

glioma；RNA,small interfering；TSSC1；U87 cell

R739.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.008

鄭州大學第四附屬醫院神經外科（郵編450000）

△通訊作者 E-mail：mayunfu126@126.com