Smac參與雷公藤甲素對(duì)TGF-β1作用的大鼠系膜細(xì)胞凋亡的研究

蘇寶鳳 酈銀芳 王曉花 張 莉 于 瑩

Smac參與雷公藤甲素對(duì)TGF-β1作用的大鼠系膜細(xì)胞凋亡的研究

蘇寶鳳 酈銀芳 王曉花 張 莉 于 瑩

目的 探討雷公藤甲素（Triptolide）對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1作用下的大鼠系膜細(xì)胞凋亡及Smac表達(dá)的影響。方法大鼠HBZY-1系膜細(xì)胞株分為對(duì)照組、TGF-β1組和低、中、高Triptolide組。低、中、高Triptolide組加入含不同濃度Triptolide(0.4、2、10 μg/L)預(yù)處理24 h后再加TGF-β1(10 μg/L)培養(yǎng)24 h。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡；Real-time PCR法檢測Smac mRNA表達(dá)；Western blot檢測Smac蛋白表達(dá)；激光共聚焦熒光顯微鏡檢測Smac蛋白亞細(xì)胞定位。結(jié)果與對(duì)照組相比，TGF-β1組系膜細(xì)胞凋亡減少，且Smac mRNA及蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)；與TGF-β1組相比，Triptolide能夠促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡，且高Triptolide組Smac mRNA及蛋白表達(dá)量最高(P＜0.05)。對(duì)照組及TGF-β1組Smac蛋白呈點(diǎn)狀分布的線粒體定位，而經(jīng)過Triptolide處理后Smac蛋白呈胞漿溶解狀及染色體濃集。結(jié)論Triptolide可通過上調(diào)大鼠系膜細(xì)胞Smac表達(dá)，促進(jìn)其由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，從而促進(jìn)TGF-β1作用下的大鼠系膜細(xì)胞凋亡。

腎小球系膜細(xì)胞；雷公藤內(nèi)酯；轉(zhuǎn)化生長因子β1；細(xì)胞凋亡；Smac

轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-βl能誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞固有表型轉(zhuǎn)化及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）聚積，在腎小球硬化及腎小管-間質(zhì)纖維化進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。雷公藤的主要有效成分之一雷公藤甲素（Triptolide）可直接抑制海曼腎炎及糖尿病大鼠足細(xì)胞的足突融合，促進(jìn)足突裂孔膜關(guān)鍵分子如Nephrin和Podocin的表達(dá)[1-3]、抑制NRK-49F細(xì)胞ECM的合成等作用[4]。促凋亡蛋白Smac/Diablo功能類似于果蠅類蛋白質(zhì)Reaper、Grim、Hid，主要作用于凋亡抑制蛋白（IAPs）[5]，解除對(duì)caspase-9和caspase-3的抑制，并可增加腫瘤壞死因子（TNF）-α生成，促進(jìn)TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)誘導(dǎo)的凋亡[6-7]。Smac在腫瘤的發(fā)生、治療、預(yù)后等方面研究較多，而在腎臟方面的報(bào)道卻較少。本文主要研究Triptolide對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響及有關(guān)Smac的分子機(jī)制，為臨床上Triptolide治療腎臟病提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）大鼠HBZY-1系膜細(xì)胞株（由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬上海長征醫(yī)院贈(zèng)送）。（2）藥品。Triptolide購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司，樣品純度大于98%。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用時(shí)用培養(yǎng)液新鮮稀釋成所需濃度。（3）主要試劑與儀器。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)粉劑(美國Gibco)，胎牛血清（HyClone），重組人TGF-β1(英國PeproTech)，RT-PCR試劑盒（杭州BIOER），SYBR Premix Ex TaqⅡ（日本TaKaRa），八聯(lián)管（荷蘭BIOplastics），Smac、β-actin引物（上海生工），小鼠抗大鼠Smac、β-actin單克隆抗體(英國Abcam)，DyLight 800-Labeled Antibody To Mouse IgG（美國LI-COR），Cy3標(biāo)記-Goat anti-mouse IgG二抗(美國Santa cruz)，Real-time PCR儀(美國ABI)，垂直平板電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)膜儀等（美國Bio-RAD），Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR），激光共聚焦熒光顯微鏡（德國Leica）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 大鼠HBZY-1系膜細(xì)胞株用含10%胎牛血清(FBS)RPMI 1640在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)條件下培養(yǎng)。分為對(duì)照組，TGF-β1組，低、中、高劑量Triptolide+TGF-β1組（低、中、高Triptolide組）。

1.2.2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 體外培養(yǎng)HBZY-1系膜細(xì)胞株，取3～10代對(duì)數(shù)生長期系膜細(xì)胞接種于12孔板，10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至40%～50%融合時(shí)，棄上清，低、中、高Triptolide組加入含不同濃度Triptolide(0.4、2、10 μg/L)的2%FBS RPMI 1640培養(yǎng)液預(yù)處理24 h后，棄上清，加入TGF-β1(10 μg/L)作用24 h。PBS洗滌，4%多聚甲醛4℃固定25 min，PBS洗滌，0.2%Triton-X 100破膜5 min，PBS洗滌，100 μL平衡緩沖液孵育10 min，滴加DNA末端轉(zhuǎn)移酶及FITC標(biāo)記的dUTP反應(yīng)混合液50 μL，同時(shí)用ddH2O代替DNA末端轉(zhuǎn)移酶作為陰性對(duì)照，37℃濕盒內(nèi)孵育1 h，2×SSC終止反應(yīng)15 min，PBS洗滌3次，Hoechst染色15 min，ddH2O洗滌，封片，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 Real-time PCR檢測Smac mRNA的表達(dá) 同法處理細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，參照BioRT Two Step RTPCR Kit說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列β-actin上游5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，下游5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，產(chǎn)物大小150 bp；Smac上游5′-GCACCTCTACCTTTCTGTCTCAA-3′，下游5′-AGTCATCTCAACTCTGGCTCCTA-3′，產(chǎn)物大小182 bp。PCR反應(yīng)體系20 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；PCR反應(yīng)95℃10 s，61℃30 s，72℃40 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。結(jié)束后讀取Ct值。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。通過2-△△Ct方法分析實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組間mRNA的表達(dá)差異，△Ct=目的基因Ct值-管家基因Ct值，△△Ct=各組△Ct-正常對(duì)照組△Ct。

1.2.4 Western blot檢測各組Smac蛋白的表達(dá) 同法處理細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液冰浴30 min，用細(xì)胞刮匙刮取細(xì)胞蛋白抽提液，移至1.5 mL EP管，高速低溫離心15 min后取上清。用BCA法測蛋白濃度，與5×上樣緩沖液混合煮沸5 min后電泳。各泳道分別加彩色預(yù)染Marker及樣品蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后加入小鼠抗大鼠β-actin（1∶5 000），Smac（1∶800）單克隆抗體，4℃過夜，次日TBST洗膜，加Dy-Light 800-Labeled Antibody To Mouse IgG二抗（1∶1 000）孵育2 h。Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜。以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。以Smac蛋白與β-actin蛋白條帶的比值進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 激光共聚焦熒光顯微鏡檢測Smac蛋白的亞細(xì)胞定位 細(xì)胞爬片后同法處理細(xì)胞。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，0.2%Triton X-100破膜15 min，PBS洗滌，5%BSA封閉30 min，加Smac單克隆抗體（1∶50）4℃孵育過夜（以0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照），PBS洗滌，加入Cy3標(biāo)記Goat anti-mouse IgG二抗室溫避光孵育2 h，PBS洗滌，Hoechst室溫避光孵育5 min，ddH2O洗滌，甘油-Tris封片，4℃避光置濕盒中，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布的用±s表示，多組均數(shù)間比較用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Triptolide對(duì)TGF-β1刺激的系膜細(xì)胞凋亡的影響 TGF-β1組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組減少；而各濃度Triptolide組細(xì)胞凋亡率較TGF-β1組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1、圖1。

Table 1 The rate of apoptosis in mesangial cells and transcription and expression levels of Smac in five groups表1 各組系膜細(xì)胞凋亡率、Smac mRNA和Smac蛋白的比較 (±s)

Table 1 The rate of apoptosis in mesangial cells and transcription and expression levels of Smac in five groups表1 各組系膜細(xì)胞凋亡率、Smac mRNA和Smac蛋白的比較 (±s)

＊＊P＜0.01；a與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組TGF-β1組低Triptolide組中Triptolide組高Triptolide組F Smac蛋白80.03±1.36a48.27±1.08 72.16±4.69a95.99±1.58a125.98±4.92a11.90＊＊n3 3 3 3 3細(xì)胞凋亡率（%）5.10±4.17a1.73±2.90 27.90±8.33a35.64±1.85a63.79±6.73a189.60＊＊Smac mRNA 100.00±3.21a77.67±1.65 98.65±1.02a114.54±3.99a138.32±1.23a28.76＊＊

2.2 Triptolide對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Smac mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，TGF-β1組Smac mRNA表達(dá)減低(P＜0.05)。各濃度Triptolide組Smac mRNA表達(dá)均高于TGF-β1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

2.3 Triptolide對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Smac蛋白表達(dá)的影響 TGF-β1組Smac蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組(P＜0.05)。與TGF-β1組比較，各濃度Triptolide干預(yù)后，Smac蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），見表1、圖2。

2.4 Triptolide對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Smac蛋白亞細(xì)胞定位的影響 對(duì)照組及TGF-β1組Smac蛋白陽性信號(hào)呈顆粒狀分布于線粒體內(nèi)，且熒光信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)較弱；Triptolide組Smac蛋白陽性信號(hào)彌散于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中，且信號(hào)強(qiáng)度較前增強(qiáng)。見圖3。

3 討論

各種腎小球疾病終末期其共同病理變化是腎小球硬化，其特征是腎小球結(jié)構(gòu)萎縮和ECM在腎組織的過度堆積，腎小球系膜細(xì)胞是產(chǎn)生ECM的效應(yīng)細(xì)胞，其過度增殖與凋亡減少與腎小球硬化是密切關(guān)聯(lián)的病理過程[8]。TGF-β1是目前發(fā)現(xiàn)的致纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一，在腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，其可促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖、增加ECM的合成，并抑制系膜細(xì)胞凋亡，故如何促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡成為當(dāng)前研究一熱點(diǎn)。

雷公藤含有多種生物活性物質(zhì)，具有免疫抑制、抗炎及抗腫瘤的作用。Triptolide是其主要活性成分，于1972年首次從雷公藤中分離出并認(rèn)識(shí)其結(jié)構(gòu)特征[9]。在腫瘤研究方面，Triptolide能通過與TRAIL結(jié)合，提高抗TRAIL的膽管癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性[10]；通過下調(diào)核因子（NF）-κB抑制人類甲狀腺癌細(xì)胞血管生成和浸潤[11]；在免疫抑制方面，Triptolide通過對(duì)白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-2受體的影響，來達(dá)到免疫抑制及誘導(dǎo)一定程度的免疫耐受[12]，還通過其他機(jī)制被用于臨床上各種自身免疫性疾病及患者器官和組織移植術(shù)后的治療中[13]。在腎臟病領(lǐng)域，Triptolide對(duì)大鼠糖尿病腎病具有顯著的治療作用，能有效地減少蛋白尿，減輕腎組織免疫損傷，促進(jìn)足細(xì)胞病變和裂孔膜蛋白結(jié)構(gòu)的修復(fù)[14]。目前Triptolide發(fā)揮作用的機(jī)制正逐步被人們所認(rèn)識(shí)，但有關(guān)其對(duì)系膜細(xì)胞凋亡的影響及有關(guān)Smac機(jī)制的研究尚不多見。

Du等[15]從HeLa細(xì)胞線粒體中提取一種與細(xì)胞色素C和dATP同時(shí)存在的因子，該因子在細(xì)胞質(zhì)中能夠提高caspases的活性，因此命名為caspase的第二個(gè)線粒體激活因子Smac，同時(shí)Verhagen等[16]從293T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了它的同源物Diablo，即低等電點(diǎn)的IAPs直接結(jié)合蛋白，因其可與IAPs蛋白直接結(jié)合并具有低等電點(diǎn)而得名。經(jīng)對(duì)比分析，Diablo與Smac蛋白為同一蛋白，合并稱為Smac/Diablo。Smac的促凋亡活性取決于其定位而不是加工。

本研究結(jié)果顯示，TGF-β1能夠抑制系膜細(xì)胞凋亡，且Smac mRNA及蛋白表達(dá)均降低。而Triptolide能夠呈濃度依賴性地有效抑制這種效應(yīng)，細(xì)胞凋亡率顯著增加，且Smac mRNA及蛋白表達(dá)均升高。另外通過對(duì)Smac亞細(xì)胞定位的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組及TGF-β1組Smac主要存在于線粒體中，呈顆粒狀分布，而Triptolide組Smac呈細(xì)胞質(zhì)及染色體濃集。有研究表明，Triptolide能夠誘導(dǎo)線粒體膜電位的丟失，促使細(xì)胞色素C釋放，caspase-9基因敲除的細(xì)胞對(duì)Triptolide是抵抗的，而caspase-8缺失的細(xì)胞對(duì)Triptolide卻很敏感，提示線粒體途徑而不是死亡受體途徑在Triptolide發(fā)揮促凋亡過程中起關(guān)鍵性的作用[17]。同時(shí)，Triptolide也能夠通過誘導(dǎo)其他因子發(fā)揮促凋亡活性。故筆者推測Triptolide能夠啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)線粒體外膜通透性增加（MOMP），跨膜電位丟失，釋放線粒體膜間蛋白包括細(xì)胞色素C、Smac/Diablo等到細(xì)胞質(zhì)，并與IAPs作用，進(jìn)一步促進(jìn)caspase依賴性和非依賴性的凋亡，促進(jìn)大鼠系膜細(xì)胞凋亡。

與大多數(shù)學(xué)者所報(bào)道不完全一致也是本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新之處的是：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凋亡程序啟動(dòng)后Smac不僅僅彌散于細(xì)胞質(zhì)，而且在細(xì)胞核中Smac的熒光強(qiáng)度也明顯增高，而Smac發(fā)揮其促凋亡作用主要在細(xì)胞質(zhì)中。Triptolide使部分Smac轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中的機(jī)制如何以及該部分的Smac是否有其他作用有待進(jìn)一步的研究。

Figure 1 The effect of Triptolide on apoptosis of mesangial cells stimulated by TGF-βl圖1 TUNEL法檢測各濃度Triptolide對(duì)TGF-βl刺激的系膜細(xì)胞凋亡的影響（FITC和Hoechst雙染，bar=20 μm，綠色熒光即凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核碎片）

Figure 2 Expression levels of Smac in five groups圖2 Western blot檢測Triptolide對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Smac蛋白表達(dá)的影響

Figure 3 Confocal fluorescence microscopy shows localization of Smac圖3 激光共聚焦熒光顯微鏡檢測Triptolide對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Smac蛋白亞細(xì)胞定位的影響（bar=5 μm）

[1]Chen BJ.Triptolide,a novel immunosuppressive and antiinflammatory agent purified from a Chinese herb Tripterygium wilfordii Hook F[J].Leuk Lymphoma,2001,42(3):253-265.

[2]Lu N,Liu J,Liu J,et al.Antagonist effect of triptolide on AKT activation by truncated retinoid X receptor-alpha[J].PLoS One 2012,7 (4):e35722.doi:10.1371/journal.pone.0035722.

[3]Chen ZH,Qin WS,Zeng CH,et al.Triptolide reduces proteinuria in experimental membranous nephropathy and protects against C5b-9-induced podocyte injury in vitro[J].Kidney Int,2010,77(6):974-988.

[4]Zhu B,Wang YJ,Zhu CF,et al.Triptolide inhibits extracellular matrix protein synthesis by suppressing the Smad2 but not the MAPK pathway in TGF-β1-stimulated NRK-49F cells[J].Nephrol Dial Transplant,2010,25(10):3180-3191.

[5]Chai J,Du C,Wu JW,et al.Structural and biochemical basis of apoptotic activation by Smac/DIABLO[J].Nature,2000,406(6798): 855-862.

[6]Varfolomeev E,Blankenship JW,Wayson SM,et al.IAP antagonists induce autoubiquitination of c-IAPs,NF-kappaB activation,and TNFalpha-dependent apoptosis[J].Cell,2007,131(4):669-681.

[7]VinceJE,WongWW,KhanN.IAPantagoniststargetcIAP1toinduce TNFalpha-dependentapoptosis[J].Cell,2007,131(4):682-693.

[8]Furuichi K,Hisada Y,Shimizu M,et al.Matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and membrane-type 1 MMP(MT1-MMP)affect the remodeling of glomerulosclerosis in diabetic OLETF rats[J].Nephrol Dial Transplan,2011,26(10):3124-3131.doi:10.1093/ndt/gfr125.

[9]Kupchan SM,Court WA,Dailey RG Jr,et al.Triptolide and tripdiolide,novel antileukemic diterpenoid triepoxides from Tripterygium wilfordii[J].J Am Chem Soc,1972,94(20):7194-7195.

[10]Panichakul T,Intachote P,Wongkajorsilp A,et al.Triptolide sensitizes resistant cholangiocarcinoma cells to TRAIL-induced apoptosis[J].Anticancer Res,2006,26（1A）:259-265.

[11]Zhu W,Ou Y,Li Y,et al.A small-molecule triptolide suppresses angiogenesis and invasion of human anaplastic thyroid carcinoma cells via down-regulation of the nuclear factor-κB pathway[J].Mol Pharmacol,2009,75(4):812-819.

[12]Zhang Y,Ma XJ.Triptolide inhibits IL-12/IL-23 expression in APCs via CCAAT/enhancer-binding protein alpha[J].J Immunol, 2010,184(7):3866-3877.doi:10.4049/jimmunol.0903417.

[13]戴澄，王平，張新濤，等.雷公藤甲素PG490-88聯(lián)合環(huán)孢素A免疫抑制誘導(dǎo)腎移植急性排斥反應(yīng)模型大鼠的免疫耐受[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(5):861-864.

[14]薛曉菲，翟麗慧，劉相，等.雷公藤甲素對(duì)2型糖尿病大鼠足細(xì)胞的影響研究[J].臨床合理用藥,2012,5(7c):7-11.

[15]Du CY,Fang M,Li Y,et al.Smac,a mitochondrial protein that promotes cytochrome-dependent caspase activation by elimination IAP inhibition[J].Cell,2000,102(1):33-42.

[16]Verhagen AM,Ekert PG.Identification of DIABLO,a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins[J].Cell,2000,102(1):43-53.

[17]Zhuang XM,Shen GL,Xiao WB,et al.Assessment of the roles of P-glycoprotein and cytochrome P450 in triptolide-induced liver toxicity in sandwich-cultured rat hepatocyte model[J].Drug Metab Dispos,2013,41(12):2158-2165.

（2013-08-07收稿 2014-02-08修回）

（本文編輯 魏杰）

讀者·作者·編者

《天津醫(yī)藥》協(xié)作辦刊單位（排名不分先后）

天津市胸科醫(yī)院

天津市第三中心醫(yī)院

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院

天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院

天津港口醫(yī)院

天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院

天津市天津醫(yī)院

天津市寧河縣醫(yī)院

天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院

天津市兒童醫(yī)院

天津市第一中心醫(yī)院

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院

天津市第二人民醫(yī)院

天津市安定醫(yī)院

天津市人民醫(yī)院

天津市公安醫(yī)院

天津華立達(dá)生物工程有限公司

天津金耀集團(tuán)有限公司

天津市第五中心醫(yī)院

海洋石油總醫(yī)院

天津海濱人民醫(yī)院

天津醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校

天津市口腔醫(yī)院

天津市第四中心醫(yī)院

天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院

Smac Involved in Promoting TGF-β1Treated Mesangial Cells Apoptosis Induced by Triptolide

SU Baofeng,LI Yinfang,WANG Xiaohua,ZHANG Li,YU Ying
Department of Pediatrics,Nanjing First Hospital,Nanjing Medical University,Nanjing 210006,China

Objective To investigate the effects of Triptolide on apoptosis of cultured rat mesangial cells treated by TGF-β1and the role of Smac in this process.MethodsThe mesangial cells were pre-treated with different concentrations of Triptolide for 24 hours,then stimulated with TGF-β1for 24 hours.Apoptotic cells were detected by TUNEL assay.Smac transcription level was determined by Real time-PCR analyses.Smac expression level was assessed using Western blot analyses.Localization of Smac was shown by confocal fluorescence microscopy.ResultsCompared with control group,TGF-β1inhibited apoptosis and Smac transcription and expression in rat mesangial cells.By contrast,Triptolide promoted mesangial cells apoptosis.In Triptolide groups,Smac mRNA and protein levels were up-regulated.Additionally,in normal and TGF-β1groups Smac protein was mainly localized in mitochondriawhile in Triptolide groupit was mainly localized in cytoplasm and nucleus with increased fluorescence intensity.ConclusionTriptolide could promote the effect that TGF-β1inhibited apoptosis of mesangial cells,through both up-regulation the expression of Smac and stimulating it translocation from mitochondria to cytoplasm and nucleus.

mesangial cells;Triptolide;transforming growth factor beta1;apoptosis;Smac

R692

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.014

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院、南京市第一醫(yī)院兒科（郵編210006）