晝夜節律對心力衰竭兔心肌細胞鈣火花發生率及時空特性的影響

李海濤，吳明，馬建林，林勁，張敬文，王裕岱，韓麗珍

（海南省人民醫院心血管病臨床診療中心1、病案室2，海南?？?70311)

·論著·

晝夜節律對心力衰竭兔心肌細胞鈣火花發生率及時空特性的影響

李海濤1，吳明1，馬建林1，林勁1，張敬文1，王裕岱1，韓麗珍2

（海南省人民醫院心血管病臨床診療中心1、病案室2，海南?？?70311)

目的 觀察不同晝夜節律下心力衰竭兔心肌細胞自發性鈣火花發生率、時空特性及對交感刺激的反應。方法家兔心衰模型采用主動脈返流加主動脈縮窄的制作，依據相隔12 h的晝夜節律將心衰動物分為靜息組及活動組，并分別按時間點分離心肌細胞(每組24個細胞)，使用激光共聚焦掃描技術制作細胞懸濁液并進行觀察，測量鈣火花發生率、幅值、半高寬、半高時程、上升時間和半衰減時間的變化。結果靜息組心肌細胞自發性鈣火花發生率及鈣火花幅值、半高寬、半高時程、上升時間和半衰減時間明顯低于活動組(P＜0.05)；給予ISO灌流后，靜息組心肌細胞鈣火花發生率及時空特性參數明顯高于活動組(P＜0.05)。結論晝夜節律可影響衰竭心肌細胞局部鈣釋放及交感反應性，其可能是夜間或靜息狀態下高發室性心律失常的機制之一。

鈣火花；室性心律失常；晝夜節律；心力衰竭

生物在進化的過程中由于受到晝夜變化環境信號的影響產生了與晝夜同步的生命活動，從而更好地適應環境，這是一種生理現象。機體心血管系統的諸多生理指標(如血壓、心率等)及心血管事件(如心律失常、心肌缺血等)均呈現出晝夜節律，這種節律與自主神經系統即交感與迷走神經對心血管生理活動的調控作用密切相關[1]。

臨床研究證實心力衰竭在進展過程中會產生自主神經系統功能的紊亂，其中交感神經興奮性增強而迷走神經張力相對減弱是心力衰竭時主要神經體液代償方式之一，可以表現為自主神經調節晝夜節律功能異常，出現與此類節律相關的心電異常，如自發除極易感性增加、室顫閾值降低等，可促使心律失常特別是室性心律失常發生，在心源性猝死患者中表現更加明顯[2]。

目前有關晝夜節律與心力衰竭心律失常研究還處于萌芽階段，對其與心衰心律失常發生的重要機制即鈣釋放是否相關及其對心臟交感興奮的影響目前尚無明確的結論。

1 材料與結果

1.1 實驗動物及分組選取成年新西蘭大耳白兔共40只，雌雄不拘，體重在2～3 kg之間，由武漢大學人民醫院實驗動物中心提供。家兔心衰模型采用主動脈返流加主動脈縮窄的方法制作。麻醉動物后將4F鞘管置入左側頸總動脈，經鞘管向心臟方向送入測壓導管，用力刺破主動脈瓣數次。如果主動脈脈搏壓升高至少50%則認為主動脈返流成功。兩周后開腹行腹主動脈縮窄術使腹主動脈直徑縮小大約50%，后關腹。兩個月后行超聲檢查，左心室收縮末期內徑超過1.20 cm，左心室射血分數低于40%者視為心衰模型制作成功，共22只納入本研究并隨機分入靜息組及活動組。

1.2 實驗材料和儀器異丙腎上腺素(ISO，250 nmol/L)，純度98.5%，購自Tocris公司；Fluo-4-AM購自日本同仁化學研究所；8通道加藥系統(美國ALA公司)；Scientific 3111型二氧化碳培養箱(美國Forma公司)；TCS SP2 AOBS激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)

1.3 心肌細胞的分離家兔處死后取心臟逆行灌流，參照文獻[3]并做改進，酶解法制備心室肌單個細胞，按照靜息組與活動組(每組11只)時間相隔12 h分離細胞，每組選取24個細胞納入研究，分離后在8～10 h內完成實驗。

1.4 激光共聚焦顯像將鈣熒光探針Fluo-4-AM與心肌細胞充分混懸，低溫離心3次，將細胞懸液室溫下避光孵育約30 min，向激光共聚焦掃描顯微鏡的載物觀察槽中充入細胞懸液，靜置3 min等細胞貼壁，選取橫紋清晰、形態完整、表面平整干凈、呈桿狀、兩端鈍圓、折光性強的心肌細胞進行觀察。顯微鏡掃描參數為：目鏡為60倍油鏡，物鏡為63倍，N.A值為1.48，掃描，X-T掃描的采樣參數為2 ms/線，0.164 μm/像素。圖片大小為512×1 024像素，即每張圖片掃描時間約1 000 ms。鈣火花的認定標準是局部熒光強度(F)的升高＞背景熒光強度(F0)的3 S.D。鈣火花參數包括：幅值(Amplitude，Fpeak/F0)、半高寬(Full width at half maximum intensity，FWHM)、半高時程(Full duration at half maximum intensity，FDHM)、上升時間(Rising time，RT、半衰減時間(Time for decay to half-peak intensity，THR)。給藥時間分別為5 min，本研究連續掃描20幅圖片然后得出每幅圖的平均鈣火花數(火花數/秒/采樣像素斷層厚度)，即為鈣火花的自發頻率。

1.5 統計學方法應用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，首先通過ANOVA檢驗進行兩因素兩水平析因設計方差分析，在不存在交互效應的前提下(檢驗水準0.05)，組間數據比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞自發性鈣火花事件次數的測定活動組細胞自發性鈣火花發生次數明顯高于靜息組(P＜0.05)。給予交感激動劑ISO后，兩組細胞上述各值均較給藥前明顯增加(P＜0.05)，但靜息組值明顯高于活動組(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組細胞給藥前后鈣火花發生率比較±s，n=24)

表1 兩組細胞給藥前后鈣火花發生率比較±s，n=24)

注：連續掃描20幅圖片，每幅圖的平均鈣火花數(火花數/秒/采樣像素斷層厚度)，即為鈣火花的發生率。

2.2 細胞鈣火花空間參數的測定活動組細胞幅值、半高寬明顯高于靜息組(P＜0.05)。給予交感激動劑ISO后，兩組細胞上述各值均較給藥前明顯增加(P＜0.05)，靜息組值明顯高于活動組(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組細胞給藥前后鈣火花空間參數的比較(±s，n=24)

表2 兩組細胞給藥前后鈣火花空間參數的比較(±s，n=24)

注：與靜息組比較，aP＜0.05。

2.3 細胞鈣火花時間參數的測定活動組細胞半高時程、上升時間和半衰減時間明顯高于靜息組(P＜0.05)。給予交感激動劑ISO后，兩組細胞上述各值均較給藥前明顯增加(P＜0.05)，靜息組值明顯高于活動組(P＜0.05)，見表3。

表3 兩組細胞給藥前后鈣火花時間參數的比較(±s，ms，n=24)

表3 兩組細胞給藥前后鈣火花時間參數的比較(±s，ms，n=24)

3 討論

大量研究證實，心源性猝死的發生存在明顯的晝夜節律。Framingham研究發現心源性猝死事件主要集中在上午7時至9時[4]。在植入心臟復律除顫器(ICD)的患者則中室性心律失常亦多發生于上午和下午兩個階段，心力衰竭患者的室性心律失常也體現出相似的時間集中趨勢[5]。

基礎研究亦證實了心力衰竭時自主神經對心臟電活動的調節能力明顯減弱，易導致心律失常特別是異位局部興奮灶興奮性升高相關的心律失常的發生，自主神經張力的晝夜節律變化可能是該現象的重要潛在機制之一[6]。晝夜節律失調狀態下，副交感神經張力逐漸降低，轉為交感神經興奮為主的過程中，心肌異位興奮點的閾值降低，自律性隨之增高，各類自發性除極的易感性增加，導致室顫閾值降低，促發頻發室性早搏甚至惡性室性心律失常發生。

本研究發現靜息組心力衰竭心肌細胞本身自發性鈣火花的發生率、峰值、半高寬、半高時程、上升時間與半衰減時間等參數均低于活動組，提示在處于靜息狀態下時，心肌細胞自身的鈣釋放功能受到晝夜節律的影響處于儲備狀態，夜間心肌細胞收縮期胞質內的游離鈣離子含量顯著低于日間活動時，減少了肌漿網中游離鈣離子的一次同步釋放(即鈣火花)的數量所致，而鈣火花釋放的時空參數也體現出釋放的強度與速率明顯低于活動時。給予交感興奮后，鈣火花事件發生率及其時空參數數值較活動組明顯增加，提示在靜息狀態下，心肌細胞鈣釋放功能較活動時對于突發性交感興奮的敏感性和反應性更高。由于鈣火花與兒茶酚胺敏感性的Ryanodine受體的調控息息相關[7]，可以推測靜息狀態下心肌細胞對于自主神經調節的瞬時失衡更加敏感。這也與心力衰竭患者上午起床后，血中兒茶酚胺濃度一過性增高，恰與心源性猝死發生的高峰時間一致的現象相吻合。

因此，我們將晝夜節律對鈣火花的發生率、峰值、半高寬、半高時程、上升時間與半衰減時間等參數的影響歸因為心力衰竭長期的自主神經功能失調，從而進一步增加了靜息狀態下衰竭心肌細胞鈣釋放功能對交感興奮的敏感性和反應性，繼而加劇靜息狀態下突發交感興奮相關心肌細胞內異常鈣離子時空分布異常，引起整體心臟電活動的一過性不穩定，導致了衰竭心臟室性心律失常的發生。

心力衰竭相關的惡性室性心律失常仍是心衰患者心源性猝死的主要原因之一，關于其發生機制以及干預治療也是目前亟待解決的難題。本研究表明晝夜節律可以直接影響衰竭心肌細胞鈣釋放功能，其機制可能是提高了心肌細胞對于交感興奮反應的敏感性，進而影響心衰患者惡性室性心律失常的發生，該因素臨床意義的確立將會為心衰心律失常的治療提供全新的思路。

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[3]Bassani JW,Bassani RA,Bers DM.Relaxation in rabbit and rat cardiac cells:species-dependent differences in cellular mechanisms[J]. J Physiol,1994,476(2):279-293.

[4]Noseworthy PA,Peloso GM,Hwang SJ,et al.QT interval and long-term mortality risk in the Framingham Heart Study[J].Ann Noninvasive Electrocardiol,2012,17(4):340-348.

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Influence of circadian rhythms in the incidence and spatiotemporal properties of calcium spark in myocardial cells in rabbits with heart failure.

LI Hai-tao1,WU Ming1,MA Jian-lin1,LIN Jin1,ZHANG Jing-wen1,WANG Yu-dai1,HAN Li-zhen2.Center of Cardiovascular Disease1,Medical Records Office2,the People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the variation of the incidence and spatiotemporal properties of spontaneous calcium spark in myocardial cells of rabbits with heart failure and their response to β-Adrenergic stimulation with different circadian rhythms.MethodsRabbit models of heart failure were induced by combined aortic insufficiency and constriction,which were divided into resting group and active group according to circadian rhythms.Myocytes were isolated at 2 opposing time points(24 cells in each group).Cell suspension was prepared by confocal laser scanning and the observed.Incidence of calcium sparks and its spatiotemporal properties were evaluated by confocal scanning.ResultsIncidence rate,amplitude,full half-height width(FWDH),full duration at half maximum(FDHM), rising time(RT)and time to half-regression(THR)of spontaneous calcium spark in myocardial cells in resting group was markedly lower than that in active group(P＜0.05).Under β-Adrenergic stimulation,the incidence rate and properties of spontaneous calcium spark in myocardial cells in the resting group were significantly greater than that in the active group.ConclusionCircadian rhythms might influence the local calcium release and sympathetic reaction in failing heart cells,which could be a mechanism of high-incident ventricular arrhythmias at night or resting state.

Calcium spark;Ventricular arrhythmia;Circadian rhythm;Heart failure

R-332

A

1003—6350（2014）21—3121—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1226

2014-03-25)

國家自然科學基金（編號：81260052)；海南省自然科學基金（編號：812147)；海南省衛生廳自然科學基金（編號：瓊衛2011-11)

李海濤。E-mail:mdlht@hotmail.com