少弱精子癥患者PRM2基因mRNA表達(dá)水平的研究

王成榮，卞廷松，丁志祥，談小林，楊凱

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046；2.常州市中醫(yī)醫(yī)院男科，江蘇常州213003；3.常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州213003)

·論著·

少弱精子癥患者PRM2基因mRNA表達(dá)水平的研究

王成榮1，卞廷松2，丁志祥3，談小林2，楊凱1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046；2.常州市中醫(yī)醫(yī)院男科，江蘇常州213003；3.常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州213003)

目的 探討少弱精子癥患者與正常人精液精子中PRM2基因mRNA的表達(dá)水平。方法選取少弱精子癥患者20例為實(shí)驗(yàn)組，精子正常者10例為對(duì)照組，比較兩組間精子濃度、活力和PRM2 mRNA水平的變化。結(jié)果PRM2 mRNA水平，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；精子濃度，兩組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；A級(jí)精子，兩組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；A+B級(jí)精子，兩組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；另外PRM2 mRNA水平與A級(jí)精子和A+B級(jí)之間存在正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)分別為0.419，0.571；P值分別為0.021，0.001)。結(jié)論少弱精子癥患者其PRM2基因mRNA表達(dá)水平低于正常人，我們推測PRM2基因的mRNA的表達(dá)水平可以在一定程度上反映患者的精子質(zhì)量水平，檢測精子中PRM2 mRNA的表達(dá)水平能在一定程度上反映睪丸精子發(fā)生過程中的表達(dá)事件，可成為男性不育癥病因研究、檢測和臨床治療效果觀察的一個(gè)重要指標(biāo)。

少弱精子癥；PRM2；mRNA

不孕不育困擾著10%～15%的育齡夫婦，且有逐年增加的趨勢(shì)，其中男性因素占30%～50%[1]。男性不育問題越來越受到人們的重視。少弱精子癥是臨床常見的男性不育原因之一。哺乳動(dòng)物精子被認(rèn)為是細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄停止的細(xì)胞，但近年的研究證實(shí)在人射出精子中存在細(xì)胞核基因組的mRNA[2]。目前對(duì)這些mRNA的來源和存在意義尚不十分清楚。有研究提示，精子中的mRNA可能有重要的功能[3-6]。PRM1幾乎存在于所有的哺乳動(dòng)物中，而PRM2只存在于人等一些哺乳動(dòng)物中[7]，這提示PRM1可能起著基本的作用，而PRM2則起著某種特殊的作用。因此我們選取PRM2來探討其mRNA表達(dá)水平與少弱精子癥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷標(biāo)準(zhǔn)(1999)，選擇2011年1月至2013年5月之間的少弱精子癥患者20例作為實(shí)驗(yàn)組，年齡20～34歲。不育病史均在1年以上，女方無不孕因素。性腺軸分泌卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、泌乳素(PRL)及睪酮(T)水平均在正常范圍，生殖器發(fā)育均正常，無其他引起男性不育的相關(guān)病史。另選取10例精子正常的男性10例作為對(duì)照組，年齡28～31歲。

1.2 材料

1.2.1 精液標(biāo)本收集所有對(duì)象禁欲2～5 d，手淫法收集全程精液于無菌潔凈廣口杯中，置37℃恒溫箱中待其液化后，依據(jù)《WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》(第4版)的操作方法，進(jìn)行精液常規(guī)檢測，包括精液量、精子濃度、精子活力等。

1.2.2 主要試劑與儀器試劑：總RNA抽提取試劑組合(購自上海申能博彩生物科技有限公司)，F(xiàn)ERMENTAS(K1622)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自上海安力特生物科技有限公司)，SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(DRR820S)試劑盒(購自寶生物工程(大連)有限公司)等；儀器包括：CFT-9200型熒光精子動(dòng)(靜)態(tài)圖像分析系統(tǒng)(北京航天瑞祺)，XH-B型漩渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)，PTC-100TM型PCR儀(Programmable Thermal Controller,MJ Research Inc，美國)，ABI 7500 Real-Time PCR System.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取每份精子需要500 μl Solution D和3.6 μl β-Mercaptoethanol，在合適的容器中混合上述試劑，加入精子樣品，混勻；在勻漿中加入50 μl的2 mol/L醋酸鈉，混勻；加入500 μl苯酚水飽和，混勻(注意：水飽和羥基苯上有一層水相保護(hù)層，取羥基苯時(shí)，應(yīng)將Tip伸到下面的有機(jī)層)；加入120 μl的氯防：異戊醇，蓋緊蓋子，劇烈混勻，冰上放置5 min；室溫高速，12 000 r/min，離心5 min，應(yīng)清晰兩相，RNA在上層水相中(如沒有分層，可補(bǔ)加少許氯仿-異戊醇，蓋緊蓋子，劇烈混勻，重新離心)；小心將上層水相移到RNase-free離心管中；加入500 μl異丙醇，顛倒混勻，-20℃置30 min；4℃14 000 r/min，離心15 min；棄上清，沉淀用75%乙醇洗兩次；徹底去除離心管內(nèi)的乙醇，室溫倒置15 min干燥；沉淀用250 μl DEPC-H2O溶解。純化出的RNA放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 第一鏈cDNA合成在PTC-100TM型PCR儀上使用20 μl的反應(yīng)體系42℃，60 min以及70℃，5 min進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下：總RNA 11 μl，oligo(dT)18 primer 1 μl，5X Reaction Buffer 4 μl，Ribolock RNase Inhibitor(20 U/μl)1μl，10 mmol/L dNTP Mix 2 μ l，RevertAid M-MuLVReverse Transcriptase(200 U/μl)1 μl。將反轉(zhuǎn)錄好的產(chǎn)物即第一鏈cDNA放于-20℃保存以備用。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)在GeneBank上查找目的基因的序列，利用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列如下：PRM2：上游引物5'-CTCCGCCCTCCTC CCCTACTC-3'，下游引物5'-CCTCTTGGCCGTGGTGTCCTT-3'；GAPDH(內(nèi)參基因)：上游引物5'-GGGG CTCTCCAGAACATCATCC-3'，下游引物5'-ACGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3'。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)使用20 μl的反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTMII(2×)10 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference DyeⅡ(50×)，DNA模板2 μl，dH2O 6 μl。將反應(yīng)管置于ABI 7500 Real-Time PCR System中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。使用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序，Stage 1：預(yù)變性Reps：1，95.0℃30 s；Stage 2：PCR反應(yīng)，Reps：40，95.0℃5 s，60℃34 s。△CT=Ct(PRM2)-Ct(GAPDH)，用2-△CT值來表示基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均使用SASS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用雙變量相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，計(jì)量正態(tài)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，偏態(tài)數(shù)據(jù)以M(P25～P75)表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組之間各參數(shù)比較兩組之間PRM2 mRNA水平、精子濃度、A級(jí)精子、A+B級(jí)精子比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組PRM2 mRNA水平、精子濃度、A級(jí)、A+B級(jí)精子的比較(±s)

表1 兩組PRM2 mRNA水平、精子濃度、A級(jí)、A+B級(jí)精子的比較(±s)

2.2 PRM2基因mRNA表達(dá)水平與精子濃度、A級(jí)精子、A+B級(jí)精子之間的相關(guān)性分析Spearman相關(guān)系數(shù)分析表明，PRM2基因mRNA表達(dá)水平與精子濃度之間無相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)=0.298，P=0.110)，PRM2基因mRNA表達(dá)水平與A級(jí)精子之間存在正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)=0.419，P=0.021)，PRM2基因mRNA表達(dá)水平與A+B級(jí)精子之間存在正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)=0.571，P=0.001)。

3 討論

PRM1和PRM2是富含精氨酸的蛋白，生精過程中它們參加DNA的組裝[8]。PRM1是一個(gè)由50個(gè)氨基酸殘基組成的成熟蛋白。PRM2 mRNA作為一個(gè)前體蛋白被翻譯，它由103個(gè)氨基酸殘基組成，且經(jīng)過蛋白水解切割，最終形成含有50個(gè)氨基酸的成熟蛋白[9]。PRM1和PRM2在精子形成的早期階段，減數(shù)分裂后的單倍體精子階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[10]。PRM1和PRM2 mRNAs在圓頭精子階段就已被發(fā)現(xiàn)存在，但這一階段并沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)蛋白[11-12]。PRM1和PRM2轉(zhuǎn)錄的翻譯發(fā)起并完成于精子發(fā)展的長形精子階段[13-15]。在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過程中，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)被永久地修改，這個(gè)過程的第一步發(fā)生在單倍體圓形精子階段，這一步包括過渡蛋白1和2(TNP1，TNP2)更換體組蛋白，在長形精子階段，TNP1和TNP2被魚精蛋白取代，在魚精蛋白結(jié)合到精子核染色質(zhì)后，基因轉(zhuǎn)錄的進(jìn)程完全停止[16]。

人類精子，只有80%左右的核蛋白完全轉(zhuǎn)換為魚精蛋白，P1/P2在0.8～1.2[17]。近來認(rèn)為，異常蛋白質(zhì)的合成與異常的mRNA滯留有關(guān)，表明魚精蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控的缺陷可能會(huì)導(dǎo)致不育男性魚精蛋白的缺乏[16]。PRM1幾乎存在于所有的哺乳動(dòng)物中，而PRM2只存在于人、鼠等一些哺乳動(dòng)物中。在小鼠身上研究發(fā)現(xiàn)，PRM2對(duì)維持精子染色質(zhì)的完整性是至關(guān)重要的，PRM2的缺陷，會(huì)導(dǎo)致精子DNA的損傷，當(dāng)進(jìn)行ICSI時(shí)，PRM2有缺陷的精子可以激活卵細(xì)胞，但僅有很少的一部分能夠發(fā)展到胚囊階段[18]。

一般認(rèn)為，哺乳動(dòng)物成熟精子的細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄和翻譯處于惰性狀態(tài)，精子的唯一使命是將遺傳物質(zhì)，即基因組DNA完整精確地傳遞給子代。但是20世紀(jì)80年代末以來，關(guān)于哺乳動(dòng)物精子中存在一些基因的mRNA的事實(shí)已被接受和承認(rèn)[2-3]。近年來也重視其存在的可能意義和應(yīng)用價(jià)值，研究者們主要從兩個(gè)方面推測和研究精子mRNA的功能[3-6]：一種可能是精子成熟和生理功能的自身需要；另一種可能是傳遞入受精卵中，在遺傳、受精卵發(fā)育等過程中起作用。

我們研究發(fā)現(xiàn)，少弱精子癥患者精液精子的PRM2基因的mRNA表達(dá)水平低于正常人(P＜0.05)，這與國外相關(guān)報(bào)道[17，19-20]一致。另外PRM2基因mRNA表達(dá)水平與A級(jí)精子及A+B級(jí)精子之間存在正相關(guān)性，但我們研究沒有提示PRM2基因mRNA表達(dá)水平與精子濃度間存在相關(guān)性。檢測精液精子中PRM2基因的mRNA表達(dá)水平能在一定程度上反映精液精子的質(zhì)量，我們推測精液精子中PRM2基因mRNA的表達(dá)水平能在一定程度上反映睪丸精子發(fā)生過程中的表達(dá)事件，可成為男性不育癥病因研究、檢測和臨床治療效果觀察的一個(gè)重要指標(biāo)。我們的研究初步探索了PRM2基因mRNA表達(dá)水平與少弱精子癥之間的關(guān)系，但是由于男科不育癥基因調(diào)控的復(fù)雜性，需要我們進(jìn)一步開展更多的研究工作，以闡明內(nèi)在復(fù)雜的作用機(jī)理。

[1]Okada H,Tajima A,Shichiri K,et al.Genome-wide expression of azoospermia testes demonstrates a specific profile and implicates ART3 in genetic susceptibility[J].PLoS Genet,2008,4(2):e26.

[2]Miller D,Ostermeier GC,Krawetz SA.The controversy potential and roles of spermatozoal RNA[J].Trends Mol Med,2005,11(4): 156-163.

[3]Miller D,Ostermeier GC.Towards a better understanding of RNA carriage by ejaculate spermatozoa[J].Hum Reprod Update,2006, 12(6):757-767.

[4]Ostermeier GC,Miller D,Huntriss JD,et al.Reproductive biology: delivering spermatozoan RNA to the oocyte[J].Nature,2004,429 (6988):154.

[5]Gur Y,Breitbart H.Mammalian sperm translate nuclearencoded proteins by mitochondtrial-type ribosomes[J].Gnens Dev,2006,20 (4):411-416.

[6]Rassoulzadegan M,Grandjean V,Gounon P,et al.RNA-mediated non-mendelian inheritance of an epigenetic change in the mouse[J]. Nature,2006,441(7092):469-474.

[7]Corzett M,Mazrimas J,Balhorn R.Protamine 1:Protamine 2 stoichiometry in the sperm of eutherian mammals[J].Mol Reprod Dev, 2002,61:519-527.

[8]Ammer H,Henschen A,Lee CH.Isolation and amino-acid sequence analysis of human sperm protamines P1 and P2:occurrence of two forms of protamine P2[J].Biol Chem Hoppe Seyler,1986,367: 515-522.

[9]Balhorn R,Cosman M,Thornton K,et al.Breed,protamine mediated condensation of DNA in mammalian sperm,in the male Gamete: from basic knowledge to clinical applications,C.Gagnon,Editor. Cache River Press:Vienna,IL,1999,55-70.

[10]Steger K,Klonisch T,Gavenis K,et al.Expression of mRNA and protein of nucleo-proteins during human spermiogenesis[J].Mol Hum Reprod,1998,4:939-945.

[11]Stewart KS,Kramer JA,Evans MI,et al.Temporal expression of the transgenic human protamine gene cluster[J].Fertil Steril,1999, 71:739-745.

[12]Steger K,Pauls K,Klonisch T,et al.Expression of protamine-1 and-2 mRNA during human spermiogenesis[J].Mol Biol Evol, 2000,17:278-283.

[13]Morales CR,Kwon YK,Hecht NB.Cytoplasmic localization during storage and translation of the mRNAs of transition protein 1 and protamine 1,two translationally regulated tran-scripts of the mammalian testis[J].J Cell Sci,1991,100:119-131.

[14]Eddy EM.Regulation of gene expression during spermato-genesis [J].Cell Dev Biol,1998,9:451-457.

[15]Kleene KC.Patterns of translational regulation in the mam-malian testis[J].Mol Reprod Dev,1996,43:268-281.

[16]Aoki VW,Emery BR,Liu L,et al.Protamine levels vary between individual sperm cells of infertile human males and correlate with viability and DNAintegrity[J].JAndrol,2006,27:890-898.

[17]Balhorn R,Reed S,Tanphaichitr N.Aberrant protamine 1/protamine 2 ratios in sperm of infertile human males[J].Experientia,1988, 44:52-55.

[18]Cho C,Jung-Ha H,Willis WD,et al.Protamine 2 deficiency leads to sperm DNA damage and embryo death in mice[J].Biol Reprod, 2003,69:211-217.

[19]Steger K,Wilhelm J,Konrad L,et al.Both protamine-1 to protamine-2 mRNA ratio and Bcl2 mRNA content in testicular spermatids and ejaculated spermatozoa discriminate between fertile and infertile men[J].Hum Reprod,2008,23(1):11-16.

[20]Kempisty B,Depa-Martynow M,Lianeri M,et al.Evaluation of protamines 1 and 2 transcript contents in spermatozoa from asthenozoospermic men[J].Folia Histochem Cytobiol,2007,45(Suppl 1):S109-113.

Research on the expression levels of PRM2 mRNA in patients with oligoasthenozoospermia.

WANG Cheng-rong1,BIAN Ting-song2,DING Zhi-xiang3,TAN Xiao-lin2,YANG Kai1.1.Nanjing University of TCM,Nanjing 210046,Jiangsu, CHINA;2.Department of Andrology,Changzhou Hospital of TCM,Changzhou 213003,Jiangsu,CHINA;3.Department of Laboratory,ChangzhouHospitalofTCM,Changzhou213003,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression levels of PRM2 mRNA in oligoasthenozoospermia patients and healthy men with normal semen sperm.MethodsTwenty patients with oligoasthenozoospermia were chosen as experimental group and 10 healthy men with normal semen sperm were chosen as control group.Then the sperm concentration,vitality and PRM2 mRNA levels between the two groups were compared.ResultsThere were statistical differences between experimental group and controlled group in the expression levels of PRM2 mRNA, sperm concentration,the percentage of grade A sperm and the percentage of grade A+B sperm(P＜0.05).And there was a positive correlation between PRM2 mRNA levels and the percentage of grade A sperm and the percentage of grade A+B sperm(correlation coefficients were 0.419 and 0.571,respectively;P were 0.021 and 0.001,respectively).ConclusionThe expression level of PRM2 mRNA may predict the patient's sperm quality in a certain extent.Since PRM2 mRNA levels could reflect the expression events in spermatogenesis,it is supposed to be an important indicator in the research of etiology,testing and clinical observation of treatment effect in male infertility.

Oligoasthenozoospermia;PRM2;mRNA

R698

A

1003—6350(2014)21—3127—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1228

2014-04-30)