不明原因性流產患者蛻膜組織液中Galectin-1變化初步研究

簡江琰，余國麗

(資中縣人民醫院婦產科，四川資中641200)

·論著·

不明原因性流產患者蛻膜組織液中Galectin-1變化初步研究

簡江琰，余國麗

(資中縣人民醫院婦產科，四川資中641200)

目的 通過檢測半乳糖凝集素-1(Galectin-1)在不明原因性流產(UHA)患者蛻膜組織液中的表達及變化，探討Galectin-1蛋白對胎盤形成的影響。方法選取2010年6月至2011年12月我科收治的流產患者40例以及正常非孕婦女志愿者20例為研究對象，其中以非孕婦女志愿者20例為A組，20例自愿要求人工流產的正常早孕婦女為B組，20例不明原因性流產患者為C組，分析三組受試對象的年齡、孕周、蛻膜組織液中Galectin-1蛋白表達、外周血中CD4+%、CD4+CD25+%、CD4+CD25+Foxp3+%變化。結果①B組與C組蛻膜組織液中Galectin-1表達均明顯高于A組，B組Galectin-1表達明顯高于C組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；②C組外周血中CD4+CD25+Foxp3+%顯著低于B組(P＜0.05)，且CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比值低于A組和B組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論UHA患者蛻膜組織中Galectin-1表達下降，且外周血CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比值下降，兩者均不利于胚胎發育，早期介入調節兩者的異常表達有望成為治療UHA的新途徑，值得引起關注。

不明原因性流產；半乳糖凝聚素-1；蛻膜組織；免疫學機制

自然流產2次或2次以上即定為復發性流產，復發性流產的病因較為復雜，排除遺傳、內分泌紊亂、解剖異常、感染等因素之后，仍然有40%～80%的發病原因不明，臨床上常將其稱為不明原因性流產(Unexplained habitual abortion，UHA)[1]。UHA的臨床處理較為棘手，隨著免疫學的發展，近些年臨床相關研究更多注重于免疫學因素所致的自然流產。動物實驗發現半乳糖凝聚素-1(Galectin-1)通過誘導T細胞凋亡、識別糖復合物等機制參與肺泡植入和維持整個妊娠過程，為胚胎的生長提供免疫抑制的環境[2]。本文通過檢測正常非孕子宮內膜、UHA患者與正常早孕婦女的蛻膜組織液中Galectin-1的表達及變化，分析探討妊娠年齡、孕周、蛻膜組織液中Galectin-1表達、外周血中CD4+%、CD4+CD25+%、CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比例是否與流產的發生有關，以此探索UHA的發生的免疫學機制，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料40例流產患者均來自我院生殖免疫科室，年齡22～38歲。A組為同期于本院宮腔鏡檢查子宮內膜并自愿參與本次調查的20例健康非孕婦女，既往無流產史，剔除遺傳、內分泌異常、自身免疫性疾病及其他疾病。B組為同期因非意愿妊娠要求人工流產的20例正常早孕婦女，經檢查排除內分泌、生殖系統解剖、感染及自身免疫性疾病史，且無先兆流產癥狀，經B超檢查胚胎發育正常。C組為2011年6～12月期間就診的20例UHA患者，均符合臨床診斷。

1.2 樣本采集及預處理采集標本所用的工具均要求相對無菌操作，A組的子宮內膜組織、B組和C組的蛻膜組織在離體20 min內用PBS沖洗，用4%多聚甲醛溶液固定，24 h后石蠟包埋，切片4 μm以備免疫組化染色用。

1.3 Galectin-1蛋白表達的檢測上述組織切片經脫蠟、消化、微波抗原修復、封閉、加入一抗、二抗、DAB顯色、蘇木素復染、脫水、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察，以PBS代替一抗作空白對照，待檢切片陽性結果為棕黃色。采用免疫組化染色法檢測樣本中Galectin-1蛋白，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 外周血中各亞細胞群相對含量的檢測采集各組受檢對象空腹肘中靜脈血5 ml，0.1 ml肝素抗凝，標本采集后4 h內采用“三標記染色法”完成測定項目。采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，PBS液將細胞濃度調整為1×107/ml，2只潔凈的流式管分別加入100 L細胞懸液，其中一管加入CD4-FITC抗體20 ml、CD25-APC抗體20 ml和20 ml抗人Foxp3-PE，混勻，另一管作為對照不加任何試劑，4℃避光孵育30 min，兩管3 000 r/min離心5 min，棄去上清，用流式細胞儀檢測，結果以熒光抗體染色陽性細胞百分率記錄表示。

1.5 統計學方法應用SPSS17.0軟件進行統計分析，所有計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

A組、B組和C組受試對象的平均年齡分別為(28.85±3.048)歲、(29.30±3.213)歲和(28.10±3.553)歲，其組間比較差異均無統計學意義(P＞0.05)；B、C兩組患者的平均孕期分別為(53.25±8.996)d和(59.95± 12.416)d，差異無統計學意義(P＞0.05)；B組和C組患者蛻膜組織液中Galectin-1表達水平明顯高于A組(P＜0.05)，而B組患者Galectin-1表達水平明顯高于C組(P＜0.05)。此外，C組患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+%明顯低于B組(P＜0.05)，且CD4+CD25+Foxp3+/ CD4+顯著低于A組和B兩組(P＜0.05)，見表1。

表1 三組婦女的各項指標比較(±s)

表1 三組婦女的各項指標比較(±s)

注：B組與A組比較，aP＜0.05；C組與B組比較，bP＜0.05；C組與A組比較，cP＜0.05。

3 討論

3.1 UHA發生的免疫學機制妊娠是一種同種移植現象，胚胎作為同種移植物在母體內存活直到分娩出母體，實際上正好反映了母體對胚胎的免疫耐受，UHA的發生與母胎免疫耐受失衡有關。胚胎著床及發育過程需要眾多因素的共同參與，包括粘附分子、細胞因子等，任何一個因素的改變均可導致妊娠結局發生變化。早孕婦女體內存在著復雜的免疫調節機制，體現為免疫耐受中的抑制反應增強，而免疫排斥功能相對減弱，維持這種微妙的平衡狀態可保護胚泡的正常著床及胚胎的正常發育。T細胞在機體免疫應答中發揮關節作用，CD4+CD25+調節性T細胞(CD4+CD25+Treg)是具有獨特免疫調節功能的T細胞亞群，其表達頻率下降與UHA發病有關[3]。Treg細胞可抑制T細胞增殖和分泌細胞因子，防止機體發生自身免疫反應，Foxp3是CD4+CD25+Treg發育和維持功能的重要調節基因，外周血Foxp3表達降調可能參與自然流產。本實驗中C組UHA患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+%顯著低于B組，且CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比值低于A組、B組，也說明Foxp3的下降與不明原因流產有關。Th1/Th2細胞因子是CD4+T細胞分泌的兩個不同細胞因子亞群，兩者互相抑制，Th1細胞因子主導細胞免疫，對胚胎有免疫損傷作用，Th2主導體液免疫，對妊娠其免疫保護作用。自身免疫性疾病的發生Th1/Th2細胞相對失衡狀態有關，母體蛻膜細胞的凋亡與增殖不斷地進行組織結構改建，是為了適應胎兒的需要。動物實驗研究發現，正常妊娠小鼠從孕早期開始，蛻膜細胞及子宮腺體上皮細胞即有少量凋亡細胞，其對維持正常妊娠有一定作用[4]。

3.2 Galectin-1基因與UHA的關系Galectin-1是第一個被發現的半乳凝素家族成員，具有高度保守的氨基酸基序編碼的糖結構識別區域(Carbohydrate recognition domains，CRD)，已知其與腫瘤的生長、粘附及轉移有關，在細胞的增殖、分化及凋亡等過程中舉足輕重。Galectin-1參與T細胞內穩態，通過一系列機制與受體結合并啟動多種信號的傳導過程，抑制Th1細胞因子的產生，延緩炎性反應效應。孔紫靖等[5]研究提出，Galectin-1在小鼠沛泡植入時著床點子宮內膜表達增高。Galectin-1 mRNA和蛋白正常早孕絨毛組織及蛻膜組織中的表達隨著孕周的增加而升高，Galectin-1在滋養細胞浸潤和胎盤形成中可能起著重要作用[6]。Galectin-1在大多數免疫赦免組織中表達，包括胎盤、視網膜等組織，使這些組織具有抑制炎癥并保護自身完整的功能。胚胎的正常生長有賴于一個合適的免疫抑制環境，通過早期干預Galectin-1的表達控制可處理免疫抑制異常所導致的不明原因性流產。本實驗中，B組自愿流產婦女與C組UHA患者蛻膜組織液中Galectin-1表達均明顯高于A組，說明Galectin-1的表達與妊娠有關，此外，B組Galectin-1表達明顯高于C組，也表明Galectin-1的表達不足參與不正常妊娠，也提示Galectin-1在妊娠過程中的重要性。

3.3 展望目前UHA的免疫性治療是建立在免疫學假說的基礎上進行的經驗性治療，通過各種藥物來作用于免疫學發病機制中的環節，使免疫反應朝著有利于妊娠維持的方向發展，臨床已有采用主動免疫治療方法[7]、淋巴療法[8]等來治療UHA，但效果仍有待臨床大規模實驗驗證。對正常早孕及UHA患者蛻膜組織液分析發現，Galectin-1在早孕過程中的降表達是引起流產發生的重要因素，與此同時對UHA患者外周血中相關定量分析發現正常早孕與UHA患者的CD4+CD25+Foxp3+%差異有統計學意義，UHA患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+有明顯降低，說明母體免疫抑制的平衡狀態受到破壞，糾正這種失衡狀態即有可能治療UHA。本文尚屬初期研究，有待進一步深入研究探討Galectin-1下調與CD4+CD25+Foxp3+的相關性，以探求為UHA提供實驗室診斷依據并探討治療途徑的可能性，同時為指導UHA患者妊娠及改善妊娠結局提供參考價值。

[1]彭婀娜,姚若進.不明原因復發性流產主動免疫治療前后封閉抗體的變化及其意義[J].實用婦產科雜志,2010,26(10):773-774.

[2]任聲權,易紹瓊,陳薇.Galectin-1的生物學活性及其研究進展[J].微生物學免疫學進展,2008,36(2):41-44.

[3]洪燕,林其德,汪希鵬.蛻膜殺傷細胞免疫球蛋白樣受體譜表達與原因不明性流產的關系[J].現代婦產科進展,2005,14(3): 214-217.

[4]張列轉,米亞英.自然流產模型小鼠蛻膜細胞凋亡及相關基因的表達[J].免疫學雜志,2007,23(5):521-523,527.

[5]潘衛,王應雄,黎剛,等.小鼠沛泡粘附時子宮內膜Galectin-1的變化[J].生殖與避孕,2004,24(3):129-133.

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Preliminary study on the change of Galectin-1 expression in deciduas tissue of patients with unexplained habitual abortion.

JIAN Jiang-yan,YU Guo-li.Department of Gynecology and Obstetrics,People's Hospital of Zizhong County,Neijiang 641200,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo detect expression and change of Galectin-1 in deciduas tissue of patients with unexplained habitual abortion(UHA),and to explore the affect of Galectin-1 protein on the formation of placenta.MethodsSurvey was conducted from June 2010 to December 2011 with 40 patients of abortion and 20 normal non-pregnant female volunteers,which were divided into group A(20 normal non-pregnant female volunteers),group B(20 patients voluntarily requesting for artificial abortion),group C(20 patients of UHA).The maternal age,gestational weeks,expression of Galectin-1 protein in deciduas tissue,changes of CD4+%,CD4+CD25+%,CD4+CD25+Foxp3+% in peripheral blood were analyzed.Results(1)Galectin-1 expression in group B and group C were significantly higher than group A(P＜0.05),which was also significantly higher in group B than group C(P＜0.05).(2)Peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+%in group C was significantly lower than that in group B(P＜0.05),and CD4+CD25+Foxp3+/ CD4+ratios was significantly lower in group C than group A and group B(P＜0.05).ConclusionIn patients UHA, Galectin-1 expression in deciduas tissue decreases,and CD4+CD25+Foxp3+/CD4+ratio in peripheral blood declines,which are both not conducive to embryonic development.Early intervention to change the abnormal expression of Galectin-1 is expected to become a new way to treat UHA.

Unexplained habitual abortion(UHA);Galectin-1;Deciduas tissue;Immunological mechanisms

R714.21

A

1003—6350（2014）21—3177—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1246

2014-04-21)

簡江琰。E-mail：2877267859@qq.com