食管癌細胞Fca9706 DNA聚合酶β基因敲除載體的構建

馮 龍，郭文濤，路武豪，孫薩迦，董子明

（1.河南中醫學院基礎醫學院，河南鄭州450008；2.鄭州大學基礎醫學院，河南鄭州450001；3.漯河醫學高等專科學校，河南漯河462002；4.鄭州大學第一附屬醫院，河南鄭州450052）

食管癌細胞Fca9706 DNA聚合酶β基因敲除載體的構建

馮 龍1，2，郭文濤3，路武豪4，孫薩迦2，董子明2

（1.河南中醫學院基礎醫學院，河南鄭州450008；2.鄭州大學基礎醫學院，河南鄭州450001；3.漯河醫學高等專科學校，河南漯河462002；4.鄭州大學第一附屬醫院，河南鄭州450052）

目的構建食管癌細胞Fca9706 DNA聚合酶β（DNA polβ）基因敲除載體，為DNA polβ基因敲除奠定基礎。方法應用體細胞基因敲除技術的方法和原理，根據DNA polβ基因序列，設計并合成2對特異性引物（UP1/UP2和DOWN1/DOWN2），通過PCR擴增獲得上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN），其中上游同源序列長1 268 bp，下游同源序列長2 150 bp，將其插入骨架載體pcDNA3.1，從而構建了DNA polβ基因敲除載體pOUT-polβ，最后用PCR、酶切和測序進行鑒定。結果經過PCR篩選，限制性酶切及DNA測序鑒定，證實上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN）2個片段插入正確。結論通過本研究所述方法，成功構建了用于食管癌細胞Fca9706 DNA polβ基因敲除載體pOUT-polβ。

基因敲除；DNA聚合酶；打靶載體；Fca9706細胞

DNA聚合酶β（DNA polymerase β，DNA polβ）是真核細胞DNA聚合酶家族的一員，為一看家基因，基因全長35 000 bp，位于第8號染色體近著絲點處，是單拷貝基因，為斷裂基因，有14個外顯子及13個內含子，轉錄1 400 bp mRNA，其啟動子位于主要轉錄起始點的上游115 bp內［1］。從酵母到哺乳類細胞的polβ均高度保守，并且廣泛分布于哺乳動物細胞核內，其表達產物是相對分子質量為39 000的單鏈小分子蛋白，是真核細胞中相對分子質量最小的DNA聚合酶。其主要功能是參與DNA損傷修復，尤其是堿基切除修復（base-excision repair，BFR），包括短片段BFR和長片段BFR［2］。

自從重組全DNA技術克隆出了DNA polβ的cDNA以后，其生物學功能越來越受到人們的關注。近年來許多學者對DNA polβ在腫瘤組織及細胞系中的突變及表達狀態等進行了系統研究，為揭示腫瘤發生的分子機制，提供了一個新的切入點。目前已經在結腸癌、食管癌、乳腺癌［3］、胃癌［4］、膀胱癌［5］、前列腺癌［6-7］等多種人類腫瘤組織中發現了DNA polβ的基因突變和（或）表達異常［8-13］。

基因敲除是在20世紀80年代發展起來的一項重要的分子生物學實驗技術，其利用了基因轉移和重組的方法，將外源DNA導入打靶細胞中，然后將外源DNA的序列與打靶細胞染色體上同源的DNA序列進行重組，從而能夠精細定點修飾以及改造目的基因片段。近年來隨著分子生物學技術的不斷發展，基因打靶也在不斷完善，并且，在干細胞基因敲除技術的基礎之上發展了體細胞基因敲除技術［14-15］，這是一種新型的研究特定人體基因生理學功能的高效、快速、特異的方法。相比之下，這種體細胞基因敲除技術操作過程更方便，更省時。自90年代起國外已有較多運用體細胞基因敲除技術研究基因結構功能的報道，但是國內尚無相關文獻報道［16-20］。本研究試圖運用體細胞基因敲除的方法，設計并構建人DNA polβ基因敲除載體，并用此載體轉染Fca9706細胞，通過進一步的篩選，建立Fca9706細胞DNA polβ體細胞基因敲除模型，為下一步研究DNA polβ的生物學功能打下牢固的實驗基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材料限制性核酸內切酶 BglⅡ、HindⅢ、XhoⅠ、ApaⅠ購自日本Takara公司；T4 DNA連接酶購自美國Promega公司；pGFM-T-easy克隆載體購自美國Promega公司；基因組DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自德國QIAGFN公司。食管癌細胞系 Fca9706、大腸桿菌DH5α、克隆載體pcDNA3.1均由本實驗室保存。PCR引物由上海生工生物技術服務公司合成。下游同源序列擴增用引物：ND1/ND2為外輪擴增引物，ND3/ND4為內輪擴增引物，ND1 5’-GCCCTGTTCTCTGTAATTTCCACG-3’；ND2 5’-GACCTCAAGCAATTCAGACCCAAGC-3’；ND3 5’-GACAGATCTCCACGAAGCCTTGTGTACTGTGTCAC-3’Bgl II；ND4 5’-AACAAGCTTCCAGAAATGGGCTAGATAGCAACTC-3’HindⅢ。上游同源序列擴增引物：UP1 5’-ACTCGAGGAGAGTGGTCACTGCTCACTG-3’XhoⅠ；UP2 5’-TGGGCCCGCTTGTTGTGACGTCACGCGTC-3’ApaⅠ。pGFM-T Fasy質粒多克隆位點兩側T7、SP6啟動子序列設計通用引物：T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’；SP6 5’-CATACGTATTTAGGTGACACTATAG-3’。

1.2 人食管癌Eca9706細胞基因組提取與純化首先富集擴增培養Fca9706細胞，3～4周后收集細胞。依照德國QIAGFN公司的人基因組DNA提取試劑盒操作說明，提取Fca9706細胞基因組。

1.3 擴增并純化目的基因上游和下游同源序列根據GenBank中DNA polβ基因序列（M13140），利用UCSC中Blat分析工具軟件分析DNA polβ基因的所有內含子、外顯子以及啟動子序列；選擇DNA polβ敲除序列上游和下游同源重組區；設計并合成上游同源重組區（UP）和下游同源重組區（DOWN）PCR引物；以Fca9706細胞基因組 DNA為模板進行擴增。目的DNA通過質量分數1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，按照快速凝膠回收試劑盒的操作說明，回收該基因片段，此即獲得純化的上游同源序列（UP）。下游同源序列（DOWN）的純化過程與此相同。

1.4 T-A克隆將上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN）的純化產物分別克隆入pGFM-T載體，轉化大腸桿菌DH5α株，通過藍白篩選，挑選白色菌落進行PCR和酶切鑒定，即獲得了陽性重組質粒pGFM-TDOWN和pGFM-T-UP。

1.5 構建質粒pOUT-DOWN用小量質粒提取試劑盒提取質粒pcDNA3.1和鑒定正確的pGFM-T-DOWN，經限制性核酸內切酶BglⅡ/HindⅢ雙酶切后，分別回收大片段（pcDNA3.1）和小片段（DOWN），具體步驟參照膠回收純化試劑盒。在T4 DNA連接酶的作用下，室溫連接2 h，產生重組質粒pOUT-DOWN。經限制性核酸內切酶BglⅡ/HindⅢ雙酶切鑒定后，篩選出鑒定正確細菌，并將其接種于5 mL含有氨芐青霉素（A+）的LB液體培養基中進行擴菌，最后再用質粒提取試劑盒提取構建成功的質粒pOUT-DOWN。

1.6 構建轉染用質粒pOUT-polβ提取質粒pOUTDOWN和pGFM-T-UP，分別用XhoⅠ/ApaⅠ雙酶切，獲得線性化的pOUT-DOWN和小片段（UP）用凝膠回收試劑盒進行純化。純化產物再用T4 DNA連接酶進行連接，室溫連接2 h，將連接產物轉化入感受態細胞大腸桿菌DH5α中，再在含氨芐青霉素的LB平板上隨機挑取5個單菌落，通過酶切和PCR擴增，篩選得到基因敲除質粒pOUT-polβ。基因敲除載體結構示意圖見圖1。

圖1 基因敲除載體pOUT-polβ結構示意圖

2 結果

2.1 基因敲除序列UP區段和DOWN區段擴增結果

PCR擴增Fca9706細胞基因組DNA，分別得到UP和DOWN同源序列。下游同源序列DOWN擴增產物，長度約為1 756 bp（圖2）；上游同源序列UP擴增產物，長度約為1 280 bp（圖3）。

圖2 DNA polβ下游同源序列DOWN的擴增結果

2.2 上游和下游基因敲除同源序列與pGEM-T載體克隆重組子鑒定結果以T7/SP6為引物，PCR擴增鑒定重組載體pGFM-T-UP，pGFM-T-DOWN，分別得到約為1 444 bp（UP）和1 932 bp（DOWN）的陽性克隆擴增片段。見圖4、5。

圖3 DNA polβ上游同源序列的擴增結果

圖4 重組質粒pGFM-T-up，擴增產物電泳結果

圖5 重組質粒pGFM-T-down擴增產物電泳結果

2.3 骨架載體pcDNA3.1與下游同源序列DOWN重組結果用限制性核酸酶切酶BglⅡ/HindⅢ雙酶切該重組載體，電泳可見，在同一泳道上有2條明亮條帶分別位于1 756 bp處和3 622 bp處，與設計一致。見圖6。

圖6 骨架載體pcDNA3.1與下游同源序列DOWN重組結果

2.4 基因敲除重組載體pOUT-polβ鑒定結果用引物UP1/UP2，PCR擴增鑒定；限制性核酸內切酶XhoⅠ/ApaⅠ、BglⅡ/HindⅢ雙酶切鑒定，FcoR V單酶切鑒定，驗證下游和上游同源序列是否正確插入到骨架載體中。電泳結果與設計一致。見圖7、8。

圖7 引物UP1/UP2擴增鑒定結果

2.5 線性化基因敲除載體鑒定結果提取鑒定正確的基因敲除重組載體，經FcoR V酶切使其線性化，電泳結果顯示，有一條明亮條帶位于5 428 bp處。見圖9。

圖8 酶切鑒定重組質粒電泳結果

圖9 線性化基因打靶載體經酶切鑒定結果

3 討論

隨著后基因組時代的到來，基因研究的熱點開始轉向基因及其表達產物的生物學功能。通過構建細胞模型，采用目的基因過量表達和（或）反義抑制等方法來研究基因的生理學功能。但反義抑制不能完全消除細胞內源基因的表達作用，往往對結果分析造成一定干擾。基因敲除通過同源重組，將細胞特定基因破壞，從而造成該基因功能喪失，能夠完全消除細胞內源基因的干擾。體細胞基因敲除技術，由于其去除了動物胚胎操作以及交配繁殖生長等過程，從而大大縮短時間，因此，體細胞基因敲除技術已成為一種研究特定人體基因生理學功能的高效快速特異的方法。

由于同源重組的過程中存在著重組效率低，以及目的片段的隨機插入等諸多因素的影響，所以，基因敲除載體的設計和構建以及篩選系統的選擇將直接影響到基因敲除策略和效率［21］，并且決定著整個實驗結果的成敗。本研究所構建的基因敲除載體全長約7.8 kb，基因結構為-5’上游同源序列-neo-下游同源序列-3’-，其中上游同源序列長約1 268 bp，下游同源序列長約2 150 bp，包含了DNA polβ基因第1、2、3外顯子和第1、2內含子的全部以及第3內含子的大部分，并且還包含了DNA polβ基因啟動子的一部分。選用neo基因作為選擇標志基因，利用含有正篩選基因neo來提高同源重組率，若同源重組如期發生，基因敲除載體的同源序列將取代與DNA polβ基因相應的同源區，而且，由于DNA polβ基因外顯子的一部分也在同源重組的過程中被敲除［22-23］，這樣將導致DNA polβ基因功能的喪失。構建成功基因敲除載體通過限制性核酸內切酶切的圖譜分析及測序證實，符合預期設計的結構。將此基因敲除載體導入受體細胞，與靶基因發生同源重組。通過G-418篩選，最終獲得DNA polβ基因缺失的細胞模型，這為后續研究人食管癌DNA polβ的生物學功能工作打下實驗基礎和依據。

［1］ Srivastava DK，Husain I，Arteaga CL，et al.DNA polymerase beta expression differences in selected human tumors and cell lines［J］. Carcinogenesis，1999，20（6）：1049-1054.

［2］ 任昀.DNA聚合酶β和腫瘤［J］.癌變·畸變·突變，2004，16（2）：125-128.

［3］ Bhattacharyya N，Chen HC，Grundfest-Broniatowski S，et al.Alteration of hMSH2 and DNA polymerase beta genes in breast carcinomas and fibroadenomas［J］.Biochem Biophys Res Commun，1999，259（2）：429-435.

［4］ Iwanaga A，Ouchida M，Miyazaki K，et al.Functional mutation of DNA polymerase beta found in human gastric cancer--inability of the base excision repair in vitro［J］.Mutat Res，1999，435（2）：121 -128.

［5］ Fydmann MF，Knowles MA.Mutation analysis of 8p genes POLB and PPP2CB in bladder cancer［J］.Cancer Genet Cytogenet，1997，93（2）：167-171.

［6］ Bergerheim US，Kunimi K，Collins VP，et al.Deletion mapping of chromosomes 8，10，and 16 in human prostatic carcinoma［J］. Genes Chromosomes Cancer，1991，3（3）：215-220.

［7］ Dobashi Y，Shuin T，Tsuruga H，et al.DNA polymerase beta gene mutation in human prostate cancer［J］.Cancer Res，1994，54（11）：2827-2829.

［8］ Hübscher U，Nasheuer HP，Syv?oja JF.Fukaryotic DNA polymerases，a growing family［J］.Trends Biochem Sci，2000，25（3）：143-147.

［9］ Iwanaga A，Ouchida M，Miyazaki K，et al.Functional mutation of DNA polymerase beta found in human gastric cancer--inability of the base excision repairin vitro［J］.Mutat Res，1999，435（2）：121 -128.

［10］董子明，趙國強，趙勤，等.人食管癌組織中DNA聚合酶β基因突變的研究［J］.中華醫學雜志，2002，82（13）：899-902.

［11］Srivastava DK，Husain I，Arteaga CL，et al.DNA polymerase beta expression differences in selected human tumors and cell lines［J］. Carcinogenesis，1999，20（6）：1049-1054.

［12］Capecchi MR.Altering the genome by homologous recombination［J］.Science，1989，244（4910）：1288-1292.

［13］董子明.DNA聚合酶β的研究現狀［J］.鄭州大學學報：醫學版，2003，38（4）：477-479.

［14］Sedivy JM，Dutriaux A.Gene targeting and somatic cell genetics--a rebirth or a coming of age？［J］.Trends Genet，1999，15（3）：88-90.

［15］Sedivy JM.Gene targeting comes to top-down drug screens［J］. Trends Biotechnol，2002，20（3）：92-93.

［16］Brown JP，Wei W，Sedivy JM.Bypass of senescence after disruption of p21CIP1/WAF1 gene in normal diploid human fibroblasts［J］. Science，1997，277（5327）：831-834.

［17］Chan TA，Hermeking H，Lengauer C，et al.14-3-3Sigma is required to prevent mitotic catastrophe after DNA damage［J］.Nature，1999，401（6753）：616-620.

［18］Park BH，Vogelstein B，Kinzler KW.Geneticd isruption of PPARdelta decreases the tumorigenicity of human colon cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（5）：2598-2603.

［19］Li G，Nelsen C，Hendrickson FA.Ku86 is essential in human somatic cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（2）：832 -837.

［20］Shulman MJ，Nissen L，Collins C.Homologous recombination in hybridoma cells：dependence on time and fragment length［J］.Mol Cell Biol，1990，10（9）：4466-4472.

［21］Thomas KR，Capecchi MR.Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells［J］.Cell，1987，51（3）：503-512.

［22］生秀杰.基因打靶的策略及其發展［J］.國外醫學：遺傳學分冊，2001，24（1）：8-10.

［23］Zhang Y，Yuan F，Wu X，et al.Preferential incorporation of G opposite template T by the low-fidelity human DNA polymerase iota［J］.Mol Cell Biol，2000，20（19）：7099-7108.

Construction of Eca9706 Cell DNA Polβ Gene Targeting Vector

Feng Long1，2，Guo Wentao3，Lu Wuhao4，Sun Sajia2，Dong Ziming2
（1.College of Basic Medical Science，Henan University of TCM，Zhengzhou 450008，China；2.College of Basic Medical Science，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China；3.Luohe Medical college，Luohe 462002，China；4.The First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

ObjectiveTo construct Fca9706 cell DNA polymerase β（DNA polβ）gene targeting vector.Methods According to the principle of somatic gene targeting and DNA polβ sequence，the two special primers were designed and synthesized（UP1/UP2 and DOWN1/DOWN2）to amplify the up homologous sequence and the down homologous sequence.The up sequence（1 268 bp）and the down sequence（2 150 bp）were inserted into skeleton vector pcDNA3.1，then DNA polβ gene targeting vector pOUT-polβ was constructed.Finally，the targeting vector was identified by PCR，restriction enzyme digestion and sequencing.ResultsThe up sequence and the down sequence were exactly inserted into skeleton vector pcDNA3.1，then DNA polβ gene targeting vector pOUT-polβ was constructed.ConclusionThe Fca9706 cell DNA polβ gene targeting vector was established successfully by using the method in this thesis.

gene targeting；DNA polymerase；targeting vector；Fca9706 cell

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.03.001

R735.1；R730.23

A

1673-5412（2014）03-0185-05

2014-03-14）

國家自然科學基金資助項目（編號：30471952）

馮龍（1981-），女，博士，講師，主要從事腫瘤發病及病因學研究。F-mail：flong01@163.com

董子明（1953-），教授，博士生導師，主要從事腫瘤病理生理學相關研究。F-mail：dongzmzzu@126.com