免疫組化與熒光原位雜交檢測乳腺癌組織中HFR-2蛋白表達與基因擴增的比較分析

李海梅，李軍擴，杜嫻娟，趙 芳

（1.安陽市腫瘤醫院病理科，河南安陽455000；2.安陽市腫瘤醫院分子生物學實驗室，河南安陽455000）

免疫組化與熒光原位雜交檢測乳腺癌組織中HFR-2蛋白表達與基因擴增的比較分析

李海梅1，李軍擴1，杜嫻娟2，趙 芳2

（1.安陽市腫瘤醫院病理科，河南安陽455000；2.安陽市腫瘤醫院分子生物學實驗室，河南安陽455000）

目的比較觀察免疫組化（IHC）法檢測乳腺癌組織中HFR-2蛋白表達和熒光原位雜交（FISH）法檢測其HFR-2基因擴增在乳腺癌分子靶向治療中的臨床意義。方法采用IHC法及FISH法分別檢測111例乳腺癌組織中HFR-2蛋白表達及HFR-2基因擴增情況。結果111例乳腺癌標本中，HFR-2蛋白（+++）者53例，（++）者47例，（+）或（-）者11例；基因擴增74例，未擴增37例。2種檢測結果呈正相關關系（rs=0.625，P＜0.05）。結論IHC法檢測HFR-2蛋白可作為乳腺癌患者是否應用赫賽汀的初篩，HFR-2蛋白表達陽性的患者有必要進一步進行HFR-2基因擴增檢測，來確定臨床治療是否應用赫賽汀。

乳腺癌；HFR-2；免疫組織化學；熒光原位雜交

近年來，一些臨床研究［1］表明，20% ～30%的乳腺癌患者存在HFR-2基因擴增或蛋白過表達的情況，與患者的轉移、不良預后及復發密切相關。針對HFR-2基因的靶向藥物郝賽汀能有效延長乳腺癌患者的生存期，但是該藥物僅對HFR-2基因過表達的患者有效，因此，檢測該基因對乳腺癌患者的治療和預后有重要的意義，也是指導郝賽汀應用的惟一指標。目前，檢測HFR-2狀態的方法有熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）等。本研究通過IHC法和FISH法檢測安陽市腫瘤醫院111例乳腺癌患者中HFR-2情況，比較2種方法的應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象選取安陽市腫瘤醫院2011年6月到2012年2月乳腺癌手術切除標本，所有患者術前均未進行任何治療，經病理證實均為浸潤性導管癌。

1.2 IHC檢測及結果判定采用IHC法按照試劑盒說明檢測HFR-2蛋白表達，一抗及試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司，結果判定參照乳腺癌HFR-2檢測指南（2009版）執行：無著色為0，任何比例的浸潤癌細胞呈現微弱、不完整的細胞膜著色為（+）；＞10%的浸潤癌細胞呈現弱至中等強度，完整但不均勻的細胞膜棕黃著色或＜30%的浸潤癌細胞呈現強且完整的細胞膜棕黃著色為（++）；＞30%的浸潤癌細胞呈現強的、完整的細胞膜棕黃著色為（+++）。由于（+）和（-）均記為陰性，在統計分析時進行合并。

1.3 FISH檢測及結果判定采用FISH法按照試劑盒說明進行 HFR-2基因擴增的檢測，該方法可將HFR-2基因標記為紅色，17號染色體基因標記為綠色。乳腺癌HFR-2探針試劑盒購自北京金菩嘉醫療科技有限公司。主要步驟包括從石蠟包埋組織中獲取4 μm切片，然后進行樣本載玻片的預處理、變性處理、探針與樣本雜交、玻片洗脫和熒光顯微鏡觀察，觀察30個腫瘤細胞，計算Ratio值（Ratio值為30個細胞核中紅色信號總數/30個細胞核中綠色信號總數）。Ratio值＜1.8為陰性，提示該樣本無HFR-2基因擴增；Ratio值＞2.2為陽性，提示樣本中HFR-2基因擴增，紅信號點成簇擴增也記為HFR-2基因擴增；Ratio值為1.8～2.2時，增加計數細胞至100個或換一位計數者重新計算，或重做FISH檢測來判斷最終結果。

1.4 統計學處理采用SPSS 13.0進行分析，計數資料比較采用χ2檢驗，IHC法與FISH法檢測HFR-2狀態之間的相關性檢驗采用Spearman等級相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

111例乳腺癌標本中，HFR-2蛋白（+++）者53例，（++）者47例，（+）或（-）者11例；基因擴增74例，未擴增37例。2種檢測結果呈正相關關系（rs= 0.625，P＜0.05）。見表1。

表1 乳腺癌組織中HFR-2蛋白表達和HFR-2基因擴增結果的關系 n

3 討論

原癌基因HFR-2定位于人的17號染色體上，編碼相對分子質量185 000的跨膜酪氨酸激酶受體蛋白，是生長因子受體家庭成員，HFR-2主要是通過配體與受體結合形成同源或異源二聚體，進一步引起胞內區的酪氨酸殘基的自身磷酸化，這種磷酸化激活了下游的信號轉導途徑，從而在腫瘤的發生、發展中起到重要的作用［2］。在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、結腸癌等的細胞中可檢測到HFR-2基因擴增或蛋白的過表達，約20%～30%的乳腺癌組織中HFR-2蛋白會發生過表達，其中90%以上是由于基因擴增造成的。HFR-2基因的擴增和蛋白的過表達提示對某些常規的化療和激素治療反應性差，預后通常較差。針對HFR-2受體的曲妥珠單抗是一種單克隆抗體，是當代乳腺癌靶向治療的代表性藥物。其治療乳腺癌的作用機制主要是通過抗體依賴的細胞毒作用和補體依賴的細胞毒作用殺傷 HFR-2高表達的腫瘤細胞；介導HFR-2受體的內吞降解而減少其在細胞表面的密度，抑制腫瘤的進一步生長［3-4］。因此，對HFR-2基因狀態的評估已經成為乳腺癌患者采用適當治療方法的基本程序［5］。

IHC法是目前臨床常用的檢測HFR-2受體蛋白表達的方法。該方法簡單易行，可重復性好。但由于其檢測對象為HFR-2受體蛋白，在標本固定和處理中可能會使蛋白質變性破壞而影響檢測結果，還有17號染色體的非整倍體現象會使檢測出現假陽性結果，加上結果主觀判斷的誤差等，可直接影響結果的可靠性。FISH法是分子遺傳學常用的檢測技術，不僅可以用于異常染色體的檢測，也可以用于觀察目標基因的擴增情況，具有高穩定性、高準確性和高靈敏性的特點。特別是在乳腺癌患者 HFR-2的檢測方面，目前認為FISH法是檢測HFR-2這條FGFR通路是否過度活化的金標準。研究［6］顯示，這2種方法的檢測結果之間相關性較好。

本項研究結果顯示，在53例HFR-2蛋白（+++）的病例中有50例基因有擴增，3例基因為未擴增；在47例HFR-2蛋白（++）的病例中有24例基因有擴增，23例基因未擴增（其中有4例為多體未擴增）；11例HFR-2蛋白（+）或（-）的病例均未見基因未擴增。結果表明在蛋白表達為（+++）和（+）或（-）的組別中2種檢測方法的符合率較高，而在蛋白表達為（++）的組別中符合率較低，值得注意的是在23例基因未擴增的HFR-2蛋白（++）病例中，有4例為多體未擴增，趙坡等［7］的研究顯示17號染色體多體的乳腺癌赫賽汀用藥組患者較未用藥組復發率低。至于17號染色體與乳腺癌患者的用藥選擇、預后等關系，國內外可參考的文獻尚少，需要進一步更深入的研究。綜合本文初步結果，我們認為臨床應用IHC法檢測乳腺癌HFR-2蛋白表達具有一定的準確度，其檢測結果對乳腺癌患者的診斷治療及預后情況有一定的指導作用。但是本研究顯示，IHC法與具有高度穩定性和可靠性的FISH法結果相比較，存在部分假陽性的檢測結果。綜上所述，IHC法檢測HFR-2蛋白可作為乳腺癌患者是否應用赫賽汀的初篩，HFR-2蛋白表達陽性的患者有必要進一步進行HFR-2基因擴增檢測，來確定臨床治療是否應用赫賽汀。

［1］ Surowiak P，Materna V，Kaplenko I，et al.Topoisomerase 1A，HFR/ 2neu and Ki67 expression in paired primary andr elapse ovarian cancer tissue samples［J］.Histol Histopathol，2006，21（7）：713 -720.

［2］ Fern? M，Haglund M，Bendahl PO，et al.Quality assured HFR2 analysis in breast cancer.Important therapeutic predictive and prognostic factor［J］.Lakartidningen，2008，105（32/33）：2181-2184.

［3］ 萬美珍，凌揚，徐志毅，等.熒光原位雜交與免疫組化檢測乳腺癌組織HFR-2基因擴增或蛋白表達情況的比較分析［J］.腫瘤基礎與臨床，2010，23（1）：16-18.

［4］ Vogel CL，Cobleigh MA，Tripathy D，et al.Ffficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HFR2-overexpressing metastatic breast cancer［J］.J Clin Oncol，2002，20（3）：719-726.

［5］ Shak S.Overview of the trastuzumab（Herceptin）anti-HFR2 monoclonal antibody clinical program in HFR2-overexpressing metastatic breast cancer.Herceptin Multinational Investigator Study Group［J］.Semin Oncol，1999，26（4 Suppl 12）：71-77.

［6］ Rutter M，Caspi A，Fergusson D，et al.Sex differences in developmental reading disability：new findings from 4 epidemiological studies［J］.JAMA，2004，291（16）：2007-2012.

［7］ 趙坡，姜學革，李曉瑛，等.FISH檢測乳腺癌HFR-2基因擴增及17號染色體多體狀況及其臨床病理學意義的分析［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18（9）：680-683.

Comparative Analysis of Immunohistochemistry and Fluorescence in Situ Hybridization in Detecting HER-2 in Breast Cancer

Li Haimei1，Li Junkuo1，Du Xianjuan2，Zhao Fang2
（1.Department of Pathology，Anyang Tumor Hospital，Anyang 455000，China；2.Molecular Biology Laboratory，Anyang Tumor Hospital，Anyang 455000，China）

ObjectiveTo explore the clinical significance of HFR-2 protein expression detected by immunohistochemistry（IHC）and HFR-2 gene amplification detected by fluorescence in situ hybridization（FISH）in molecular targeting therapy of breast cancer.MethodsThe HFR-2 protein expressions and the HFR-2 gene amplification in the 111 cases of breast cancer tissues were detected by IHCa nd FISH，respectively.ResultsThe numbers of patients showed IHC（+++），IHC（+++）and IHC（+/-）were 53 cases，47 cases and 11 cases，respectively.The HFR-2 gene amplification existed in the 74 cases，no amplification existed in the 37 cases.There was positive correlation between the two results（rs=0.625，P＜0.05）.ConclusionBefore herceptin therapy，the immunohistoche-mistry can be first used to detect the HFR-2 protein expressions，and then in the cases woth positive expressions of HFR-2，the HFR-2 gene amplifications should be further tested to guide the herceptin therapy in the treatment of breast cancer.

breast cancer；HFR-2；immunohistochemistry；fluorescence in situ hybridization

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.03.004

R737.9

A

1673-5412（2014）03-0196-03

2013-04-19）

李海梅（1980-），女，主治醫師，主要從事腫瘤病理診斷及研究。F-mail：296156543@qq.com