木犀草素抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231中SDF-1α/CXCR4通路的作用

李文仿，歐 琴，張 華，趙宗彬，王 耕

（1.湖北醫藥學院附屬太和醫院普外三科，湖北十堰442000；2.湖北醫藥學院基礎醫學院微生物學教研室，湖北十堰442000）

木犀草素抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231中SDF-1α/CXCR4通路的作用

李文仿1，歐 琴2，張 華1，趙宗彬1，王 耕1

（1.湖北醫藥學院附屬太和醫院普外三科，湖北十堰442000；2.湖北醫藥學院基礎醫學院微生物學教研室，湖北十堰442000）

目的探討木犀草素對乳腺癌細胞MDA-MB-231中SDF-1α/CXCR4信號通路抑制作用。方法采用不同濃度的木犀草素處理乳腺癌細胞MDA-MB-231，觀察乳腺癌細胞MDA-MB-231的細胞增殖、趨化運動及CXCR4蛋白表達。結果木犀草素明顯抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖，明顯抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231 CXCR4蛋白表達，并明顯抑制SDF-1α/CXCR4對乳腺癌細胞MDA-MB-231的激活。結論木犀草素可抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖及SDF-1α/CXCR4介導的乳腺癌細胞的信號激活作用，在預防乳腺癌復發及轉移中可能有重要的作用。

木犀草素；乳腺癌；CXCR4

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其發病率正在逐年升高，而且日趨年輕化，給患者生活帶來嚴重不良影響。最近研究［1］發現木犀草素是一種在各種蔬菜及水果中廣泛分布的天然黃酮化合物，具有抗腫瘤作用，可以通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡機制抑制甲狀腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞的生長，在體外對人肝癌細胞（HepG2、J5）等10多種腫瘤細胞有抑制增殖作用，具有很好的抗腫瘤前景。

CXCR4與其特異性配體在乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌等多種腫瘤趨化轉移中發揮重要作用，抑制多種腫瘤細胞侵襲，轉移。乳腺癌細胞較正常乳腺細胞的CXCR4表達明顯增高，而在乳腺癌高轉移的靶器官肝、骨髓及肺中高表達其配體基質細胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α），推測SDF-1α/ CXCR4介導了乳腺癌細胞靶向轉移［2］。拮抗乳腺癌細胞中CXCR4功能在減少乳腺癌細胞轉移中發揮重要作用［3］，提示CXCR12/CXCR4能介導腫瘤細胞向特異性的部位“歸巢”，即誘導腫瘤細胞器官特異性的轉移。乳腺癌細胞MDA-MB-231存在高表達CXCR4，并且后者與MDA-MB-231細胞惡性程度及高轉移、復發、侵襲密切相關。本研究探討木犀草素對MDA-MB-231的增殖及SDF-1α/CXCR4信號通路激活抑制作用，并觀察其作為乳腺癌侵襲轉移抑制治療輔助措施的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人乳腺癌細胞MDA-MB-231購自中國科學院細胞庫上海保藏中心，細胞在含體積分數10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、100 g·mL-1鏈霉素的DFMN培養基中，于37℃，體積分數5%CO2的條件下培養，每3～4 d傳代1次，取對數生長期的細胞進行實驗，CXCR4單克隆抗體購自美國Abcam公司，p-AKT、GADPH及PI3K單克隆抗體購自美國Cell Signal公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞計數實驗 用DFMN培養基調整乳腺癌細胞MDA-MB-231濃度為1.5×105 mL-1，將2 mL調整濃度后的細胞均勻貼壁在6孔培養皿，3 h后，乳腺癌細胞MDA-MB-231完全貼壁，將培養皿的培養基換為含濃度為0、6、12 μg·mL-1木犀草素的培養基，每種濃度設3個重復孔并取其均值，分別于培養后24 h、48 h、72 h計數乳腺癌細胞MDA-MB-231。

1.2.2 細胞趨化實驗 選擇直徑為8 μm的Trans well趨化小室，基底用膠原蛋白包被30 min后將Trans well趨化小室倒置，將100 μL調整細胞濃度后的培養基置于趨化小室基底，貼壁4 h后輕輕吸去培養基，將趨化小室倒置在含木犀草素0、6、12 μg·mL-1的500 μL培養基的下室培養12 h，然后將趨化小室上室培養基換為含100 ng·mL-1的SDF-1α的培養液，乳腺癌細胞MDA-MB231趨化運動4 h后，棉簽輕輕刮去沒有發生趨化運動的細胞，將小室基底以含質量分數2%甲苯胺藍的40 g·L-1低聚甲醛染色1 h，顯微鏡下隨機計數10個視野的已經發生趨化運動的細胞。

1.2.3 Western Blot實驗 將乳腺癌細胞MDA-MB-231分別用12 μg·mL-1的木犀草素處理24 h、48 h，然后提取蛋白，取100 μg等量蛋白做Western Blot實驗，在體積分數10%分離膠上等蛋白條帶分離清晰，以硝酸纖維薄膜轉膜，PBS清洗，體積分數5%脫脂奶粉封閉1 h，然后分別加入濃度為1∶1 000的CXCR4（或PI3K）一抗，4℃過夜，PBS洗滌3次，每次10 min，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗1 h，PBS洗滌3次，每次10 min，然后加入顯色劑，X光機讀片。

1.2.4 木犀草素對乳腺癌細胞MDA-MB-231 SDF-1α信號激活抑制作用研究乳腺癌細胞MDA-MB-231用12 μg·mL-1的木犀草素培養基分別處理0 h、24 h和48 h，然后，觀察含100 ng·mL-1SDF-1α培養基處理乳腺癌細胞MDA-MB-231 10 min后對AKT激活作用。取含磷酸化酶抑制劑的RIPA液裂解細胞，并將100 μg蛋白進行Western Blot試驗，在體積分數10%分離膠上等蛋白條帶分離清晰，以硝酸纖維薄膜轉膜，PBS清洗，體積分數5%胎牛血清封閉1 h，然后分別加入濃度為1：1 000的p-AKT的一抗4℃過夜，PBS洗滌3次，每次10 min，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗1 h，PBS洗滌3次，每次10 min后加入顯色劑，X光機讀片。

2 結果

2.1 木犀草素抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖結果細胞計數實驗表明，木犀草素可顯著抑制乳腺癌細胞增殖，6、12 μg·mL-1木犀草素作用24 h、48 h及72 h均可明顯抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖，12 μg·mL-1木犀草素較6 μg·mL-1木犀草素抑制細胞增殖能力更強。見表1。

表1 木犀草素抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的結果

2.2 木犀草素抑制SDF-1α/CXCR4介導的乳腺癌細胞MDA-MB-231趨化運動及CXCR4表達乳腺癌細胞MDA-MB-231中具有高表達CXCR4的臨床特點，而且高表達CXCR4與乳腺癌細胞趨化轉移密切相關，本趨化實驗發現木犀草素處理12 h后，乳腺癌細胞MDA-MB-231趨化活性完全被抑制，12 μg·mL-1木犀草素幾乎完全抑制了乳腺癌細胞MDA-MB-231的趨化運動（表2）。Western Blot檢測CXCR4蛋白表達變化，發現12 μg·mL-1木犀草素作用24 h、48 h可顯著抑制CXCR4蛋白表達（圖1）。

表2 木犀草素對SDF-1α/CXCR4介導的乳腺癌細胞MDA-MB-231趨化抑制作用

圖1 Western Blot檢測CXCR4蛋白表達

2.3 木犀草素抑制 SDF-1α對乳腺癌細胞 MDAMB-231的信號激活本實驗表明，乳腺癌細胞MDAMB-231經含SDF-1α濃度為100 ng·mL-1培養基作用10m in后，可明顯激活乳腺癌細胞MDA-MB-231 AKT信號通路，但是經12 μg·mL-1木犀草素處理24 h、48 h后，AKT信號通路可明顯被抑制。PI3K激酶在AKT激活中發揮重要作用，木犀草素可明顯抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231中PI3K的表達。見圖2。

圖2 木犀草素對SDF-1α對乳腺癌細胞MDA-MB-231的信號激活的抑制圖像

3 討論

目前，乳腺癌的治療包括傳統的乳腺癌改良根治術，乳腺癌被認為是全身性疾病，即使是早期乳腺癌，診斷時也有早期血液轉移，因此，主張手術后行規范的化療，但化療藥物一般均有毒副反應重、對腫瘤細胞選擇性差，尤其對機體免疫系統的破壞可導致腫瘤復發，最終導致患者死亡。最近研究［4-6］報道日常膳食中的黃酮化合物木犀草素有促進乳腺癌細胞MCF-7、MDAMB-231凋亡作用，抑制FGF對AKT及FRK的激活，可增加乳腺癌細胞Bax表達，下調Bcl-xl表達，同時抑制FGF介導的MAPP信號通路的激活。乳腺癌細胞MDA-MB-231具有FR、PR受體陰性，Her2也表達陰性，高度侵襲、轉移的特征，臨床治療化療不敏感，容易出現遠處轉移及復發，嚴重威脅患者生命健康。本組結果表明，木犀草素可抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖，12 μg·mL-1木犀草素抑制癌細胞增殖作用更為明顯，提示木犀草素具有抗乳腺癌潛能。

CXCL12也稱為SDF-1α，生理情況下廣泛分布于免疫器官、腦、心、肝、腎和肺等組織。CXCR4是7次穿膜的G蛋白偶聯受體，與SDF-1α相互作用，構成的SDF-1α/CXCR4生物學軸介導細胞遷移，與多種惡性腫瘤侵襲轉移密切相關。Müller等［2］在2001年首次研究了趨化因子在轉移性乳腺癌中的功能，發現乳腺癌常轉移至骨髓、肺和肝臟等高表達CXCL12的部位，而很少轉移到腎臟、皮膚、肌肉等低表達CXCL12的部位。CXCR4特異性抑制劑可明顯抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231肺轉移［7］。CXCR4表達水平與乳腺癌腋窩淋巴結和遠處轉移存在明顯相關，CXCR4的高表達與腫瘤細胞的惡性程度及預后相關［8］。本研究結果表明，木犀草素可明顯抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231中CXCR4蛋白表達，抑制SDF-1α/CXCR4介導的乳腺癌趨化運動。

本研究也發現SDF-1α可明顯激活AKT，從而促使乳腺癌細胞MDA-MB-231發生增殖、轉移，但木犀草素明顯抑制了乳腺癌中AKT的激活。因此，我們的研究表明，木犀草素抑制了乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖，而且抑制了SDF-1α/CXCR4介導的乳腺癌細胞MDA-MB-231趨化運動，明顯抑制CXCR4蛋白表達，抑制SDF-1α/CXCR4介導的AKT激活，表明木犀草素是潛在的重要的天然抗腫瘤物質。

參考文獻：

［1］ Sadzuka Y，Sugiyama T，Shimoi K，et al.Protective effect of flavonoids on doxorubicin-induced cardiotoxicity［J］.Toxicol Lett，1997，92（1）：1-7.

［2］ Müller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis［J］.Nature，2001，410（6824）：50 -56.

［3］ Park BH，Kook S，Lee S，et al.An isoform of C/FBPβ，LIP，regulates expression of the chemokine receptor CXCR4 and modulates breast cancer cell migration［J］.J Biol Chem，2013，288（40）：28656-28667.

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［7］ Shepard JB，Wilkinson RA，Starkey JR，et al.Novel guanide-substituted compounds bind to CXCR4 and inhibit breast cancer metastasis［J］.Anticancer Drugs，2014，25（1）：8-16.

［8］ Xu TP，Shen H，Liu LX，et al.The impact of chemokine receptor CXCR4 on breast cancer prognosis：a meta-analysis［J］.Cancer Fpidemiol，2013，37（5）：725-731.

Inhibition Effect of Luteolin on SDF-1α/CXCR4 Signal Pathway in Breast Cancer Cells MDA-MB-231

Li Wenfang1，Ou Qin2，Zhang Hua1，Zhao Zongbing1，Wang Geng1
（1.Department of General Surgery，Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China；2.Department of Microbiology，School of Basic Medical Science，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China）

ObjectiveTo study the inhibition Fffect of luteolin on SDF-1α/CXCR4 signal pathway in breast cancer cells MDA-MB-231.MethodsDifferent concentrations of luteolin were used to treat breast cancer cells MDA-MB-231，the cell enhancement，chemotactic migration and expression of CXCR4 were observed in breast cancer cells MDA-MB-231.ResultsLuteolin inhibited significantly the cell proliferation，the expression of CXCR4 and SDF-1α/CXCR4 activation in the breast cancer cells of breast cancer cells MDA-MB-231.ConclusionLuteolin can inhibit the cell proliferation and SDF-1α/CXCR4 signal activation of breast cancer cells MDA-MB-231，and may be important in the prevention of recurrence and metastasis of breast cancer.

luteolin；breast cancer；CXCR4

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.03.005

R737.9；R730.23

A

1673-5412（2014）03-0199-04

2013-10-13）

李文仿（1979-），男，博士，主治醫師，主要從事乳腺外科方面的研究。F-mail：2671422764@qq.com

王耕（1966-），男，主任醫師，主要從事乳腺外科方面的研究。