重癥急性胰腺炎大鼠腎損傷的血清及尿液生化指標變化趨勢研究

申 偉，李清懷，李筱雨，嚴 麗，張霖雷

（河北醫科大學第二醫院甲狀腺外科，河北 石家莊 050017）

·論 著·

重癥急性胰腺炎大鼠腎損傷的血清及尿液生化指標變化趨勢研究

申 偉，李清懷*，李筱雨，嚴 麗，張霖雷

（河北醫科大學第二醫院甲狀腺外科，河北 石家莊 050017）

目的 觀察重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）大鼠腎損傷的血清及尿液生化指標變化趨勢。方法 選取健康雄性Sprague-Dawley大鼠240只，按照隨機數字表隨機均分為8組各30只，即SAP不同時間點組（SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h、24h組）和對照組。比較各組大鼠血清淀粉酶（amylase，AMY）、血肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血尿酸（uric acid，UA）以及尿液中肌酐（urine creatinine，UCr）濃度、腎損傷分子（kidney injury molecule，KIM）-1以及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetyl amino glycosidase enzymes，NAG）含量的變化。結果 SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h和24h組SCr、BUN、UA濃度、KIM-1含量和NAG相對濃度均高于對照組，UCr濃度均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 SAP腎損傷中，腎小管的損傷早于腎小球的損傷。KIM-1和 NAG作為判定腎小管損傷的指標，敏感度和特異度均優于Cr、BUN和UA，且能早期診斷SAP時腎損傷。

胰腺炎，急性壞死性；急性腎損傷；生物學標記

1 材料與方法

1.1 一般資料：選取健康雄性Sprague-Dawley大鼠240只（購自河北省實驗動物中心），月齡1～3個月，平均（1.8±0.7）個月，清潔級，體質量 250～300g，平均（274.2±12.4）g。按照隨機數字表將240只大鼠隨機均分為 SAP不同時間點組（SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h、24h組）和對照組，每組 30只。各組大鼠月齡、體質量差異均無統計學意義（P＜0.05），具有可比性。

1.2 模型制備及標本采集：大鼠實驗前14h開始禁食，自由飲水，參照郝建志等［2］的方法制備 SAP模型。對照組大鼠進入腹腔后僅翻動十二指腸部數次即關腹。造模后，所有大鼠均皮下注射生理鹽水5mL，以補充血容量。SAP模型制備成功后于1h、3h、6h、9h、12h、18h和24h分批取材。心臟抽血約4mL，2 000r／min離心10min分離血清，將血清標本裝入 EP管中，－80℃低溫保存。12h后大鼠均為無尿狀態，故留取1h、3h、6h、9h和12h組大鼠尿液，1 000r／min離心 10min，取上清，－20℃低溫保存。

1.3 實驗方法及檢測指標

1.3.1 血清指標測定：采用碘－淀粉比色法測定血清淀粉酶（amylase，AMY），采用高效液相色譜法測定血清肌酐（serum creatinine，SCr），采用尿素酶－連續監測法測定血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）以及采用尿酸酶過氧化物酶偶聯－終點法測定血清尿酸（uric acid，UA）濃度。

1.3.2 尿液標本指標測定：采用堿性苦味酸法測定尿肌酐（urine creatinine，UCr），采用固相夾心法酶聯免疫吸附實驗法測定腎損傷分子（kidney injury molecule，KIM）-1以及按照大鼠β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetyl amino glycosidase enzymes，NAG）測定試劑盒說明書測定NAG含量。

1.4 腎損傷的病理學評分：在400倍光鏡下隨機選3個視野，每個視野選10個腎小管評分。腎小管明顯擴張，細胞扁平為 1分；刷狀緣損傷為 1分，脫落為2分；細胞漿空泡 1分；間質水腫 1分；腎小管腔內有脫落的壞死細胞未形成管型或碎片為 1分，形成管型或碎片為2分。

1.5 統計學方法：應用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析，對所有資料進行正態性檢驗及方差齊性檢驗。計量資料以表示，組間比較采用F檢驗，兩兩比較采用 q檢驗。腎損傷評分采用Kruska-lWallis檢驗，兩兩比較采用 Nemenyi法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清指標比較：SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h和24h組血AMY含量呈逐漸增高趨勢，且高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h組SCr、BUN和UA濃度呈逐漸增高趨，24h組有所下降，但高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 尿液指標比較：SAP各時間點組UCr濃度呈逐漸下降趨勢，且低于對照組，KIM-1含量和NAG相對濃度呈逐漸增高趨，且高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

2.3 大鼠腎損傷的病理學評分：SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h和24h組大鼠腎損傷的病理學評分分別為（6.00±3.57）、（18.77±6.52）、（55.89±10.85）、（111.71±15.33）、（146.94±15.45）、（171.22± 16.93）和（208.00±13.23）分，呈逐漸增高趨勢，均高于對照組的（3.33±3.20）分，經 Kruska-lWallis檢驗比較差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步進行Nemenyi檢驗示，除對照組與 1h組、18h組和 24h組差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表1 不同組別AMY、SCr、BUN和UA水平變化趨勢Table 1 The change of AMY，SCr，BUN and UA level in different groups（n＝30，）

表1 不同組別AMY、SCr、BUN和UA水平變化趨勢Table 1 The change of AMY，SCr，BUN and UA level in different groups（n＝30，）

*P＜0.01vscontrol group ＃P＜0.01vsSAP 1h group △P＜0.01vsSAP 3h group ▲P＜0.01vsSAP h group ▼P＜0.01vsSAP 9h group ☆P＜0.01vsSAP 12h group ★P＜0.01vsSAP 18h group byqtestSAP：severe acute pancreatitis；AMY：amylase；SCr：serum creatinine；BUN：blood urea nitrogen；UA：uric acid

Groups AMY（U／L） SCr（μmol／L） BUN（mmol／L） UA（μmol／L）Control group 596.9±248.1 50.31±9.75 7.03±4.01 92.23±28.98 SAP 1h 1 437.9±331.9*54.80±9.38 8.95±3.37 104.40±31.86 SAP 3h 2 052.0±290.4*＃56.30±8.69 11.83±3.46*113.70±28.81*SAP 6h 3 152.9±301.4*＃△70.19±11.25*＃△15.56±4.02*＃△145.46±33.30*＃△SAP 9h 4 944.5±308.5*＃△▲76.13±12.72*＃△18.96±3.88*＃△▲188.33±33.97*＃△▲SAP 12h 5 162.8±315.9*＃△▲▼85.78±13.15*＃△▲▼25.17±4.94*＃△▲▼217.78±43.19*＃△▲▼SAP 18h 8 236.7±381.9*＃△▲▼☆126.11±14.24*＃△▲▼☆53.11±5.53*＃△▲▼☆384.44±60.02*＃△▲▼☆SAP 24h 11 800.0±200.7*＃△▲▼☆★71.33±12.10*＃△☆★21.33±3.06*＃△▲☆★168.00±15.10*＃△☆★F 4 712.944 132.242 381.583 200.882 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 不同組別KIM-1、UCr和NAG水平變化趨勢Table 2 The change of KIM-1，UCr and NAG level in different groups （n＝30，）

表2 不同組別KIM-1、UCr和NAG水平變化趨勢Table 2 The change of KIM-1，UCr and NAG level in different groups （n＝30，）

*P＜0.01vscontrol group ＃P＜0.01vsSAP 1h group △P＜0.01vsSAP 3h group ▲P＜0.01vsSAP 6h group ▼P＜0.01vsSAP 9h group byqtestSAP：severe acute pancreatitis；KIM-1：kidney injury molecule-1；UCr：urine creatinine；NAG：β-N-acetyl amino glycosidase enzymes

Groups KIM（ng／L） UCr（mmol／L） NAG／UCr（U／mmol）Control group 40.60±29.07 2.01±0.33 17.18±9.13 SAP 1h 62.22±31.12*1.91±0.34 18.66±8.95 SAP 3h 78.09±34.02*1.81±0.30 51.21±11.62*＃SAP 6h 87.83±33.22*＃1.12±0.32*＃△108.93±10.42*＃△SAP 9h 101.44±35.94*＃△0.95±0.26*＃△134.05±10.10*＃△▲SAP 12h 119.37±30.78*＃△▲▼0.53±0.25*＃△▲▼205.25±10.16*＃△▲▼F 22.400 120.92 1 614.741 P 0.000 0.000 0.000

3 討 論

SAP是臨床常見的急腹癥之一，它不僅引起胰腺本身及胰周的炎性腫脹、滲出和壞死，而且常導致全身重要臟器功能的損害，是一種發病急、進展快、并發癥多、病死率高的嚴重疾病，病死率可達20%～40%［3－4］。SAP時常并發多系統器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），成為SAP的主要死亡原因。腎衰竭是SAP常見的并發癥。筆者使用3.5%牛磺膽酸鈉溶液逆行注射大鼠胰膽管，制備大鼠 SAP模型，SAP 1h組血清AMY比對照組明顯升高（P＜0.01），表明SAP模型建立成功。SAP各組大鼠腹部膨隆，腹腔內有大量腹腔積液，胃腸極度擴張，體液丟失于腹腔及腹膜外間隙中，致使血容量銳減，血壓下降，腎濾過壓降低，腎小球濾過率下降，加之腎臟缺血，易于發生腎損傷。SAP各時間點組病理學評分均高于對照組。

SCr、BUN和UA為3種非蛋白質含氮化合物，分別是肌酸、蛋白質和核酸的代謝產物，主要經腎小球濾過隨尿排除，腎臟對其重吸收和排泌量少。腎功能發生障礙時，由于腎小球濾過率下降，血液中3種化合物的濃度增加［5］。SCr、BUN、UA均于造模6h后才有明顯的升高，由此可見SAP發生后并未立即發生腎小球功能的損傷［6］，12h后又加快，這種變化如同 AMY的變化一樣要經歷一個“平臺期”，這就又進一步證實了病程中機體的抗損傷作用，但這種抵抗作用畢竟有限。三者于18h達到高峰，隨即開始下降，但至24h的數值仍然高于正常值水平。這種下降說明在腎損傷病程的后期，SCr、BUN和UA不能作為判定指標。UCr主要來自血液，經過腎小球過濾后隨尿液排除體外，腎小管基本不吸收且排出很少。UCr測定與 SCr剛好相反，UCr越高，說明腎臟的排除肌酐毒素功能越強，反之越差。臨床上，如果UCr排出增多，一般可說明，腎功能好轉，病情在向好的方向發展，反之越差。SCr、BUN和UA為反映腎小球功能的經典指標，能很好地體現出腎小球濾過功能受損的情況。但由于腎臟代償功能強大，只要有 30%功能腎單位存在，上述指標就可以維持在正常水平，所以 SCr、BUN和UA不是反映腎功能的靈敏指標，不能作為腎功能早期受損的指標。

近年來研究［7］表明，SAP敗血癥時的腎衰竭是由于免疫或毒素的應激引起的急性腎小管凋亡導致的，而不是簡單的血流動力學紊亂引起的。因此，對于腎小管功能的評估受到越來越多的重視和研究。

Ichimura等［8］采用表象差異分析在缺血－再灌注大鼠腎細胞中識別一種新的Ⅰ型跨膜蛋白，命名為KIM-1，其大量表達于缺血－再灌注損傷后再生的近曲小管上皮細胞，而在正常腎組織中表達甚微。當腎小管上皮細胞受損時，KIM-1的產物能夠通過尿中排出，尿中KIM-1水平能夠反映組織中KIM-1表達情況及炎癥反應程度，并與腎臟功能密切相關。因此，檢測尿中KIM-1水平可以間接評價腎臟損傷的情況。同時研究［9］表明，KIM-1不受尿液理化性質改變的影響，可在尿中長時間保持穩定，避免了測定尿液其他指標時所存在的干擾。本研究結果顯示，KIM-1在造模1h后就已經開始升高，幾乎與SAP的發生“同步”，并且隨著病情的加重而持續上升，而此時腎小管尚未有鏡下的改變，直至造模后3h鏡下才出現腎小管上皮細胞的水腫，9h偶見上皮細胞壞死。因大鼠于造模12h之后處于無尿狀態，故18h與 24h未能留取足夠的尿液進行檢測。但是KIM-1的變化趨勢與腎損傷評分的變化趨勢一致。因此在SAP造成的腎損傷中，腎小管的損傷要早于腎小球的損傷。

NAG是廣泛存在于各組織溶酶體中的一種高相對分子質量（140 000）的酸性水解酶，近端腎小管上皮細胞中含量特別豐富，正常情況下，血清中的NAG不能通過腎小球濾過膜，因而NAG可作為腎小管功能損害最敏感的指標之一［10－11］。因尿酶濃度隨尿流率而變動，用“酶單位／肌酐”比值來計算酶排出率，以校正尿量變化對尿酶活性的影響，效果較好［12］。本研究結果表明，不做校正的NAG值變化于造模9h后呈下降趨勢，經校正后，于造模9h后仍然呈現上升趨勢，從而排除了尿量減少對結果的影響，使指標更貼近于實際情況。NAG同KIM-1一樣也于造模后1h開始升高，敏感度較高。

KIM-1、NAG作為反映腎小管功能受損的指標，在SAP發生早期即有所升高，明顯早于其他反映腎損傷的指標。因此，可以對腎損傷進行早期診斷，特異性和敏感性均較高。這也驗證了SAP并發腎損傷的起始部位是腎小管，支持了炎癥介質和細胞因子的作用，因此腎小管發生損傷決定著腎臟疾病的預后和轉歸。至于腎小球損傷是否是由腎小管損傷而引起，需要進一步研究。本研究采用的腎損傷組織學評分，主要反映的是腎小管損傷，造模后18h與24h評分差異無統計學意義，此時鏡下觀察腎小管損傷嚴重，上皮細胞壞死脫落，管腔內管型形成，甚至阻塞管腔，且18h的鏡下也開始出現腎小球的瘀血，這說明腎小球出現形態學改變后，腎小管損傷的加重相對停止。腎小管的損傷或許是個觸發因素，加重了腎小球損傷。但具體作用機制尚需研究。

綜上所述，腎損傷的程度隨SAP病程延長和病情加重呈遞增趨勢，但發病9h是個轉折點，損傷程度相對減緩；且腎小管的損傷早于腎小球損傷的發生。KIM-1和NAG作為判定腎小管損傷的指標，敏感度和特異度均較好，優于Cr、BUN和UA，且能夠進行早期診斷，對判斷SAP時腎損傷的程度及預后有重要意義。

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［12］胡英華，胡紅文，趙磊.尿酶檢測在診斷早期腎臟損傷中的應用［J］.河北醫科大學學報，2010，31（7）：849－850.

（本文編輯：趙麗潔）

CHANGE OF SERUM AND URINE BIOCHEMICAL INDEXES IN KIDNEY DAMAGE RATS WITH SEVERE ACUTE PANCREATITIS

SHEN Wei，LI Qinghuai*，LI Xiaoyu，YAN Li，ZHANG Linlei
（Department of Glands Surgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050017，China）

ObjectiveTo observe the change of serum and urine biochemical indexes in kidney damage rats with severe acute pancreatitis（SAP）.MethodsA total of 240 healthy male Sprague-Dawley rats were selected as the research objects，and the rats were randomly divided into eight groups（each group，n＝30）by random number table，named as SAP different time group（SAP 1h，3h，6h，9h，12h，18h，24h group）and the control group.The serum amylase（AMY），serum creatinine（SCr），blood urea nitrogen（BUN）and blood uric acid（UA），the urine creatinine（UCr），renal injury molecules（KIM）-1 andβ-N-acetyl amino glycosidase enzymes（NAG）of different groups were compared.ResultsThe levels of SCr，BUN and UA of SAP 1h，3h，6h，9h，12h，18h，24h group were higher than those of the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The UCr levels of SAP 1h，3h，6h，9h，12h group were lower than those of the control group，the levels of KIM-1 and NAG were higher than those of the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionIn SAP kidney damage，the renal tubular injury is earlier than the capillary damage.The KIM-1 and NAG are therenal tubular damage judge indexes，the sensitivity and specificity were better than Cr，BUN and UA for early diagnosis of SAP kidney damage.

pancreatitis，acute necrotizing；acute kidney injury；biological markers重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）因其發病兇險，病情復雜多變，常并發多臟器功能衰竭，當病程發展為腎功能障礙后，病情變得更加復雜、危重。目前，學術界對于SAP并發腎損傷的研究多集中在病因及機制和針對其機制所采取的抑制炎癥細胞和炎癥因子的治療措施上［1］。但對于其發病的詳細過程還不甚明了，尤其是腎損傷病程中血清和尿液生化指標的變化還沒有一個完整的監測。為此，筆者認為誘導建立大鼠 SAP模型，動態觀察腎臟損傷的血清及尿液生化指標變化趨勢并探討其發生機制，可為臨床診治提供參考。現報告如下。

R576

A

1007-3205（2014）10-1117-04

2014－06－27；

2014－08－15

河北省科技支撐計劃項目（08276101D-84）

申偉（1982－），女，河北石家莊人，河北醫科大學第二醫院醫師，醫學博士，從事甲狀腺外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：liqh4011＠163.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.001