干擾素γ釋放試驗診斷肺外結核的應用價值

賈晨光，李秀武，姚黎明*，劉建強，黃 俊，陳銀芳，張 雷

（1.河北省胸科醫院骨科，河北 石家莊 050041；2.武漢海吉力生物科技有限公司，湖北 武漢 430075）

干擾素γ釋放試驗診斷肺外結核的應用價值

賈晨光1，李秀武1，姚黎明1*，劉建強1，黃 俊2，陳銀芳2，張 雷2

（1.河北省胸科醫院骨科，河北 石家莊 050041；2.武漢海吉力生物科技有限公司，湖北 武漢 430075）

目的 比較干擾素γ釋放試驗（interferon gamma release assay，IGRA）與結核菌染色涂片、結核菌培養、結核菌素試驗（tuberculin skin test，TST）在肺外結核診斷中的敏感性，探討IGRA方法在肺外結核中的應用價值。方法 采集75例經臨床診斷為肺外結核病患者的新鮮外周血，將IGRA檢測結果與傳統的檢測方法（結核菌染色涂片、結核菌染色涂片培養、TST）的檢測結果進行比較。結果 75例肺外結核患者中，IGRA檢測陽性率為84.0%，結核菌染色涂片（8.0%），結核菌培養（5.3%），TST檢測（52.0%），IGRA檢測陽性率均明顯高于其他臨床常用檢測方法，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論 IGRA試劑檢測法診斷肺外結核，敏感性明顯高于傳統的檢測方法，有很好的臨床應用價值。

結核；干擾素γ釋放試驗；診斷

目前結核的診斷方法較多，但檢測結果的敏感 性存在較大差距。特別是在肺外結核的臨床檢測上，該現象更為突出，主要原因之一就是肺外結核缺乏肺部病變的特點，病變的部位多隱匿，臨床癥狀不明顯［1］，且結核分枝桿菌培養時間長，敏感性低，以致臨床上經常誤診和漏診。國內目前肺外結核的診斷方法主要有影像學結合結核分枝桿菌涂片、培養及結核菌素試驗（tuberculin skin test，TST）等。結

核分枝桿菌的涂片簡單，但敏感性和特異性不高。結核菌培養耗時較長，容易延誤病情的診治。TST是一種較古老的檢測方法，存在特異性不高等難以克服的缺陷。近年來，干擾素 γ釋放試驗（interferon gamma release assay，IGRA）作為一種新型的檢測方法逐漸被各大醫院及檢驗單位所接受。這類試驗采用酶聯免疫吸附和（或）酶聯免疫斑點方法定量檢測全血和（或）外周血單核細胞在結核桿菌特異性抗原刺激下釋放干擾素γ的水平，用于診斷結核分枝桿菌感染及結核病。該檢測方法及其相關試劑盒已被美國食品藥品監督管理局批準用于臨床，疾病預防控制中心為其制定了使用指南［2－3］。而且該方法在診斷活動性結核方面具有很高的敏感性［4］。本研究對75例經臨床影像學和組織學確診為肺外結核的患者進行菌檢、TST及IGRA方法檢測，旨在探討各種方法在肺外結核診斷中的敏感性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2013年1—5月肺外結核病患者75例（河北省胸科醫院18例，武漢市醫療救治中心31例，北京老年醫院26例），均依據臨床表現、體征、細菌學、影像學、病理或抗結核治療有效明確診斷為肺外結核病，男性46例，女性29例，年齡18～67歲，平均（38.0±16.4）歲。其中結核性腦膜炎 7例，結核性腹膜炎10例，淋巴結結核5例，腎結核5例，關節結核16例，脊柱結核32例。

1.2 主要試劑及儀器：恒溫水浴鍋，結核菌純蛋白衍生物，抗酸染色液，結核桿菌培養基，結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒（武漢海吉力生物科技有限公司研制）。

1.3 方法

1.3.1 結核菌染色涂片：取患者晨痰，均勻涂布于蓋玻片上（略厚），干燥固定后滴加石碳酸復紅染色8～10min，3%鹽酸酒精脫色1～2min，脫色時輕搖玻片，直到圖片顏色脫去為止，流水沖洗后用堿性美藍染液復染30s，流水沖洗，待干后用顯微鏡油鏡觀察細菌的染色性和形態。

1.3.2 結核菌培養：取患者晨痰，向痰標本中加入1～2倍體積的 4%NaOH，渦旋振蕩 1min，靜置15min后取0.1mL處理標本樣于培養基斜面，置于37℃恒溫培養箱培養，接種后3d、7d觀察，此后每周觀察1次，有菌落生長后用抗酸染色驗證，若同時為陽性記錄為陽性，否則為陰性，至第8周仍無細菌生長記錄為陰性。

1.3.3 TST：取0.1mL藥液（含結核菌素純蛋白衍生物 5U）注射于受試者前臂掌側皮下，48～72h后檢查注射部位反應，測量并記錄硬結的平均直徑，＜5mm者為陰性，5～15mm者為陽性，＞15mm或者注射部位出現丘疹、水泡、潰爛、壞死者為強陽性。

1.3.4 IGRA檢測：受試者用BD肝素鋰抗凝采血管抽取5mL靜脈血，即刻輕柔顛倒混勻3～5次，使抗凝劑充分溶解。3h內將采集的全血分裝到3種不同的培養管中，“T”為添加了結核特異性抗原ESAT-6、CFP-10的測試培養管，“N”為本底對照培養管，“P”為添加了非特異刺激原植物血凝素的陽性對照培養管，每種培養管分裝 1mL，分裝前需要顛倒混勻3次以上，分裝后輕柔顛倒培養管 5次并立刻置于 37℃培養箱中，靜置培養（22±2）h后取出，離心收集上清液，然后用雙抗體夾心法定量檢測上清中干擾素γ的含量，最后計算刺激培養系統中特異性升高的干擾素γ的量來判定是否為結核桿菌感染陽性。

1.4 統計學方法：應用SPSS13.0軟件對數據進行處理。計數資料以百分率表示，采用配對χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

IGRA、結核菌染色、結核菌培養、TST檢測肺外結核的陽性率分別為 84.0%（63／75）、8.0%（6／75）、5.3%（4／75）、52.0%（39／75）。IGRA檢測陽性率明顯高于其余3種方法，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 4種檢測方法診斷肺外結核的結果比較Table 1 The results of four test methods for extrapulmonary tuberculosis （n）

3 討 論

近年來結核病疫情呈明顯上升趨勢，全球所有傳染性疾病中，結核病已成為成年人的首要死因。我國是全球22個結核病高負擔國家之一，是世界上僅次于印度的第2結核病大國，中國第四次全國結核病流行病學調查顯示活動性肺結核患病率為367／10萬，菌陽肺結核患病率為 160／10萬，涂陽肺結核患病率為 122／10萬［5］。

肺外結核是指發生在肺部以外的全身其他臟器的結核病。國外資料顯示肺外結核占結核病的25%～30%，在中國占結核病的9.7%～11.8%，病死率占 14.1%～17.6%［6－7］。目前診斷肺外結核仍存在很多困難，主要原因是肺外結核變化大，臨床表現復雜，缺乏特異性的表現。結核菌培養是診斷結核的可靠依據，但常規培養需要2個月的時間，快速培養也需要1周，而且陽性率取決于采集標本中細菌的數量。本研究中抗酸染色方法的陽性率為8.0%（6／75），結核菌培養方法的陽性率只有5.3%（4／75），可能與采集標本的質量有關；影像學作為輔助診斷方法，由于其使用的局限性，對肺外結核診斷存在較大困難；TST是臨床常用檢查結核的免疫學方法，雖然操作簡單，觀察結果方便，但由于TST中使用的純蛋白衍生物的某些抗原成分與卡介苗和環境中的非結核分枝桿菌的抗原成分相同，易于發生交叉反應，使得其有較高的假陽性和假陰性，對臨床結核病的診斷意義不大。本研究中TST雖然比結核菌染色和結核菌培養的陽性率要高，但仍然很難滿足臨床診斷的需求。IGRA作為一種新的酶免疫檢測方法，其應用的原理是，機體感染結核分枝桿菌后，體內會產生特異性的效應 T淋巴細胞，其在體外再次受到結核菌特異性抗原的刺激時，會釋放干擾素γ，通過檢測干擾素γ的水平或計數分泌干擾素γ的數量，從而判斷機體是否感染結核分枝桿菌，輔助診斷結核病。由于 IGRA方法選擇的特異性抗原只存在于結核桿菌，且在是卡介苗和大多數非結核桿菌中普遍缺失的RD1區基因片段所表達的蛋白，因此，IGRA方法檢測的陽性率會明顯高于TST［8］。本研究中IGRA陽性率遠遠高于其他3種檢測方法。

篩選結核桿菌的潛伏感染是IGRA的主要應用領域，但IGRA在肺外結核中的應用相關報道卻不多，原因可能是肺外結核病例比較難收集。本研究75例患者是由全國在結核診斷方面有較好成就的3家醫院共同收集的，雖然病例數并不很多，還不能全面充分滿足統計學分析的要求，但本研究體現出來的IGRA技術優越性，值得以后進一步探索。在肺外結核的診斷中，痰結核桿菌檢測方法在診斷中出現了極大挑戰，一方面是因為肺外結核活動性結核的并發癥出現情況并不多，難以通過痰菌檢測來判斷；另一方面是因為痰菌檢測的檢出率本身并不高。目前肺外結核的主要輔助診斷技術為TST，但由于其接種抗原的選擇一直沿用年代較久的純蛋白衍生物，在應用中存在明顯缺陷，因此急需進行改良，而改良該技術可能會需要較長時間，在這段時間里選出一種擁有較高敏感性的肺外結核診斷方法刻不容緩。

本研究結果表明IGRA方法是能夠滿足臨床應用需求的，但考慮到檢測費用較高的原因，推廣該方法可能還需要一定時間。

［1］YOON HJ，SONG YG，PARK WI，et al.Clinical manifestation and diagnosis of extrapulmonary tuberculosis［J］.Yonsei Med J，2004，45（3）：453－461.

［2］MAZUREK GH，JEREB J，LOBUE P，et al.Guidelines for using the QuantiFERON-TB gold test for detecting Mycobacterium tuberculosisinfection.United States［J］.MMWR Recomm Rep，2005，54（RR-15）：49－55.

［3］LALVANI A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century：new tools to tackle an old enemy［J］.Chest，2007，131（6）：1898－1906.

［4］DIEL R，LODDENKEMPER R，NIENHAUS A.Evidencebased comparison of commercial interferon-gamma release assays for detecting active TB：a metaanalysis［J］.Chest，2010，137（4）：952－968.

［5］全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組.第四次全國結核病流行病學抽樣調查報告［J］.中華結核和呼吸雜志，2002，25（1）：3－7.

［6］SIU GK，ZHANG Y，LAU TC，et al.Mutations outside the rifampicin resistance-determining region associated with rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis［J］.J Antimicrob Chemother，2011，66（4）：730－733.

［7］SHARMA SK，MOHAN A.Extrapulmonary tuberculosis［J］.Indian J Med Res，2004，120（4）：316－353.

［8］AHMAD S.New approaches in the diagnosis and treatment of latent tuberculosis infection［J］.Respir Res，2010，11：169.

（本文編輯：趙麗潔）

VALUE OF INTERFERON-GAMMA RELEASE TEST IN DIAGNOSING EXTRAPULMONARY TUBERCULOSIS

JIA Chenguang1，LI Xiuwu1，YAO Liming1*，LIU Jianqiang1，HUANG Jun2，CHEN Yinfang2，ZHANG Lei2
（1.Department of Orthopedics，Hebei Chest Hospital，Shijiazhuang050041，China；2.Department of Wuhan Hygeianey Bioscience Co.Ltd，Wuhan430075，China）

ObjectiveTo compare the sensitivity of interferon gamma release test（IGRA）with suptum smear，sputum culture and tuberculin slcintest（TST）in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis.To investigate the value of IGRA method in extrapulmonary tuberculosis.MethodsFresh peripheral blood samples were collected from 75 patients of clinically diagnosed extrapulmonary tuberculosis.The result wascompared with those of traditional gold standard test methods（sputum smear and sputum culture，TST），and their clinical application value further were analyzed.ResultsIn 75casesof extrapulmonary tuberculosis，the positive rate by IGRA reagent test was 84.0%，sputum smear 8.0%，sputum culture 5.3%，TST test 52.0%.The positive rate of IGRA was significantly higher than those of other common methods，and the differences were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionIn the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis，the sensitivity of IGRA reagent is significantly higher than those of the traditional test methods，IGRA has a good clinical value.

tuberculosis；interferon-gamma release tests；diagnosis

R52

A

1007-3205（2014）10-1129-03

2014－06－04；

2014－08－22

河北省科學技術研究與發展計劃項目（12277754）

賈晨光（1975－），女，河北唐縣人，河北省胸科醫院副主任醫師，醫學碩士，從事骨科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：yaolm24＠126.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.004