水解超高產大豆“中黃35”功能性蛋白的制備

葛杰，陳虎，劉超，蘇豫梅

(新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052)

水解超高產大豆“中黃35”功能性蛋白的制備

葛杰，陳虎，劉超，蘇豫梅

(新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052)

以新疆超高產大豆“中黃35”品種為研究對象，采取傳統提取、酶單因素實驗和雙酶解法等多種方法制備大豆的功能性蛋白，并對其SDS－PAGE電泳、溶解曲線、氮溶指數和濁度等基本性質進行了初步分析。實驗結果表明“中黃35號”大豆蛋白的提取最優條件是:豆水比(g:mL)為1∶13，pH值為8，提取時間為2 h。酸性蛋白酶水解大豆蛋白的最適合工藝條件為:初始pH值為3.5，溫度為45℃，酶用量為6%，固液比為1∶8，水解時間為8 h。采用SDS－PAGE電泳分離出2條酸性蛋白條帶，其相對分子質量分別在95 kD和60 kD左右。

大豆;功能性蛋白;雙酶解法;酸性蛋白

大豆是新疆的主栽農作物之一。大豆蛋白含有多種氨基酸成分，特別是含有人體所必需的8種氨基酸，是一類優質植物蛋白資源。超高產大豆“中黃35”在新疆于2006、2007年創造的產量分別達5 197 kg/hm2和5 577 kg/hm2，2010年在兵團農八師148團試驗田更是達到6 088.35 kg/hm2的超高產指標。有研究表明:植物蛋白的結構大都十分緊密，相對分子質量較大，不易被人體消化吸收，吸收率也往往低于動物蛋白;大豆蛋白在酸性條件下(pH值為3.0～4.5)溶解性很差，而酸性飲料的pH值正好在此區間。大豆的蛋白質含量高達40%，且含有豐富的不飽和脂肪酸、鈣、磷、鐵、膳食纖維等，不含膽固醇，具有很高的營養價值。但目前大豆蛋白質的提取率較低，大多在60%以下。80%～88%的大豆蛋白可溶于水。將大豆蛋白水解后，其相對分子質量減小，結構疏松，更有利于通過人體內酶的作用使吸收率大大提高。目前，關于新疆大豆蛋白在酸性條件下的應用研究不多，特別是對不同方法處理后超高產大豆其酸性蛋白的生理生化性質研究鮮見報道。

本實驗采用超高產大豆“中黃35”品種，研究大豆分離蛋白制備方法，旨在提高大豆蛋白質的提取率，研究大豆蛋白質的溶解性受原料加熱處理、溶出時的固液比、pH值、溫度等條件的影響，優化大豆蛋白的提取工藝，制備大豆功能性蛋白并對其理化性質進行分析。

采用雙酶解法研制功能性可溶蛋白，利用SDS－PAGE電泳分析其酸性蛋白的分子量，為功能性大豆蛋白系列產品的開發提供一定的理論依據和方法的指導，使其應用范圍更加廣泛。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新疆超高產大豆“中黃35號”。

1.2 試驗準備

選用伊犁地區伊寧縣吉里于孜鎮種植推廣的“中黃35號”大豆品種，于2012年5月6日播種，每公頃施用150 kg氮磷鉀復合肥作為種肥，初花期每公頃追施150 kg尿素。

1.3 測定方法

1)用傳統方法分離大豆蛋白。蛋白質提取率=(漿料中蛋白質總量/原料中蛋白質總量)× 100%。采用不同的浸泡pH值、磨漿溫度、豆水比和磨漿pH值，試驗優化大豆材料的最佳磨漿工藝。

2)用雙酶解法研制功能性可溶蛋白。根據pH值適用范圍(酸性、中性)，采用2種酶聯合水解，分別添加中性蛋白酶和酸性蛋白酶，比較大豆蛋白的水解率大小以確定最優加酶解體系。

3)大豆酸性蛋白氮溶指數的測定。采用Lorry法測定蛋白質含量。

4)大豆酸性蛋白溶解度曲線及濁度的測定。

5)SDS－PAGE電泳分析大豆酸性蛋白分子量。

2 結果與分析

2.1 傳統方法分離大豆蛋白。

傳統提取方法是采用堿溶酸沉淀法。將脫脂后的低溫大豆在堿性條件下溶解，pH值控制在7.5～8.0左右，離心取清液;然后pH值控制在4.5，在酸性條件下讓蛋白沉淀，離心取沉淀;再將pH值控制在7.0～7.5左右，所得的凝乳漿在中性條件下溶解，最后噴霧干燥得到成品大豆分離蛋白。

試驗表明“中黃35號”大豆蛋白的提取的最優條件是:豆水比為1∶13，pH值為8，提取時間為2 h。大豆蛋白的等電點為4.5～5.0，是酸性蛋白。盡管大豆中含有水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白和醇溶蛋白，但其主要成分為堿溶蛋白。丙酮可降低溶液的介電常數，破壞蛋白質的水化膜，可使蛋白質在一定條件下沉淀析出;調節蛋白質溶液的pH值到等電點附近，有利于蛋白質的沉淀。大豆總蛋白曲線見圖1。

2.2 雙酶解法研制功能性可溶蛋白

稱取已提取的大豆蛋白100 g，加入去離子水1.5 L，調pH值為8.0后充分攪拌。2 h后9 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液調pH值為4.5，此時溶液出現乳白色沉淀。將溶液9 000 r/min、4℃離心20 min，取沉淀，加入10倍(10 mL/g)的去離子水，調pH值為7.0。待沉淀完全溶解后調pH值為4.0～6.0，加入適量植酸酶，30～40℃下水浴振蕩30 min，90℃高溫滅酶10 min。調pH值為3.0～6.0，加入蛋白酶適量，30～40℃下酶解30 min，90℃高溫滅酶10 min，然后高溫高壓處理15 min，噴霧干燥，得成品功能性大豆蛋白－酸性蛋白。制備的蛋白如圖2所示。

圖1 “中黃35號”大豆總蛋白曲線

圖2 “中黃35”大豆酸性蛋白的制備

隨著酶用量的增大，水解液中的氨基氮含量升高。酶用量超過8%以后，大豆蛋白質含量略有下降。這主要是由于酶濃度過大，發生自溶(自水解)現象，導致對底物的水解作用減弱，故取最適酶用量為8%。試驗中先加中性蛋白酶，后加酸性蛋白酶，大豆蛋白水解率可達45%。

2.3 大豆酸性蛋白氮溶指數的測定

采用Lorry法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標準物做標準曲線測定上清液蛋白濃度，氮溶指數為上清液蛋白濃度與總蛋白濃度的比值。

2.4 大豆酸性蛋白溶解度曲線的測定

測定蛋白分別在pH值為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時的氮溶指數，每個樣品測定3次取平均值，將各點連成折線即為溶解度曲線(表1和圖3)。

表1 “中黃35”大豆酸性蛋白溶解曲線表

圖3 “中黃35號”大豆酸性蛋白溶解曲線

2.5 大豆酸性蛋白濁度的測定

蛋白質的濁度表征蛋白溶液外觀的透明程度。常見的用紫外/可見分光光度計對某特定波長的光吸收進行測量，吸光度越高，濁度就越大。試驗中將功能性蛋白用去離子水配置成1%的溶液，磁力攪拌1 h，用紫外/可見分光光度計在600 nm處測定其吸光值，結果如表2所示。

表2 “中黃35”大豆酸性蛋白濁度表

2.6 SDS-PAGE電泳分析大豆酸性蛋白分子量

凝膠電泳采用Laemmli法，在不連續緩沖系統上進行SDS－PAGE電泳分析，濃縮膠和分離膠的濃度分別為40 g/L和120 g/L，考馬斯亮藍R－250染色。還原電泳樣品緩沖液中含10 mmol/L β－巰基乙醇，其他成分與非還原SDS－PAGE電泳緩沖液相同。樣品濃度為2‰，上樣量為20 μL。采用SDS－PAGE電泳分離出2條酸性蛋白條帶，其相對分子質量分別在95 kD和60 kD左右，如圖4所示。

圖4 “中黃35”大豆酸性蛋白SDS－PAGE電泳分析

3 討論

大豆功能性蛋白質的溶解性受原料加熱處理、溶出時的固液比、pH值、共存鹽類、溫度等條件的影響。有報道認為:浸提時，加水量越多，蛋白質的提取率就越高;但是加水太多，酸沉時蛋白的損失量增加;加水太少，大豆蛋白的溶出率大大下降，還會增加后續各工序的難度。蛋白質的溶解度與浸提pH值有很大的關系。pH值太低時，蛋白組分解;pH值太高，易發生胱賴反應，生成有毒物質。溫度的高低對蛋白收率、純度及色澤有顯著影響。浸提溫度過高，會使蛋白變性，同時黏度增加，分離困難，耗能提高。筆者認為浸提時間越長，蛋白的溶出率就越高;但一定的時間后，蛋白制得率隨浸提時間的延長而無顯著的變化。漿料粒度也被認為是影響蛋白制備的一個因素，漿料粒度太細反而會使蛋白制得率和浸提效果下降，同時增加了過濾分離的難度。加酸速度和攪拌速度不容易控制，試驗中到等電點時大豆蛋白質凝集下沉緩慢，試管中上清液混濁。豆水比和浸泡pH值對大豆分離蛋白的提取率具有顯著影響。

大豆分離蛋白提取方法較多:①酸沉堿提法是一種傳統的分離提取方法，缺陷是耗酸、耗堿量大，廢水處理費用高，產品收率低，但依然常用。②膜分離法，根據大豆蛋白的相對分子質量大小、形狀及膜與大豆蛋白的適應性，選擇膜材料對大豆蛋白提取液超濾分離、超濾凈化，噴霧干燥成粉狀大豆分離蛋白。③反膠束萃取分離法，利用反膠束技術從全脂豆粉萃取大豆蛋白，可一次萃取50%左右。大豆蛋白反膠束萃取技術的優點明顯，主要是選擇性高、操作方便、放大容易，反膠束相可循環利用，分離和濃縮同步進行;缺點是蛋白質在現有反膠束體系中穩定性不高，易導致萃取前后蛋白質的活性損失大，制約其工業化應用。④反相高效液相色譜法，Tris(三甲基氨基甲烷緩沖劑)和2－巰基乙醇(分析級)用于分離大豆蛋白。大豆蛋白分離樣本可用于組織化蛋白、大豆粉、豆奶、強化嬰兒大豆的生產，使用前均要測定其蛋白質含量。樣品溶于水，然后于注樣前用0.122 μm經無菌處理的多酚濾紙過濾。全部樣品和標樣保存在3℃或冰凍條件下。樣品溶液在分析當天現配，并保存在冰上備用。

4 結論

“中黃35號”大豆蛋白的提取的最優條件是:豆水比為1∶13，pH值為8，提取時間為2 h。酸性蛋白酶水解大豆蛋白的最適工藝條件為:初始pH值為3.5，溫度為45℃，酶用量為6%，固液比為1∶8，水解時間為8 h。采用SDS－PAGE電泳分離出2條酸性蛋白條帶，其分子量分別在95 kD和60 kD左右。該試驗數據為加強超高產大豆深加工中的研究開發，提高農副產品的附加值，以及對功能性大豆蛋白系列產品的進一步研究提供了一定的理論依據和方法的指導。

［1］王志民.水解動物蛋白的酶法制備及應用［J］.食品工業科技，1998(5):12－14.

［2］程潤達，張淑茹.提高分離蛋白得率的研究［J］.食品科學，1998，19(7):14－17.

［3］梁歧.溫度、水分對大豆組織化蛋白物理性能的影響［J］.食品科學，2000，2:39－40.

［4］Laurent B.Electroacidification of Sobean proteins for production of isolate［J］.Food Chemistry，1997，9:52－56.

［5］王莉娟，陶文沂.大豆肽體外抗氧化活性研究［J］.生物加工過程，2008，6(4):69－73.

［6］劉靜，陳均志.大豆多肽分離純化方法研究進展［J］.食品工業科技，2006，27(9):171－174.

［7］盧亞萍，馮杰.大豆多肽的性質及其研究進展［J］.飼料添加劑，2005，7:26－29.

［8］蒲首垂，王金水.酶解蛋白制備生物活性肽進展［J］.糧食與油脂，2005(3):17.

［9］梁鐵，工燕燕，張陳.楊梅黃酮降血脂作用研究［J］.中國實驗診斷學，2009，13(12):37－39.

［10］Zhang B，Li QX，Li LL，et al.Effects of soybean small Peptides on nitrogen balance，nutrient digestibility and several indices in the Portal Veinous Plasma of goats［J］.Small Ruminant Researeh，2007，72:1－10。

［11］崔鳳霞.海參膠原蛋白生化性質及膠原肽活性研究［J］.青島:中國海洋大學，2007.

(責任編輯 何杰玲)

Hydrolyzed Soy Protein“Medium Yellow 35”Functional Preparation

GE Jie，CHENG Hu，LIU Chao，SU Yu－mei
(College of Agricultural Sciences，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China)

This experiment adopts the super－high－yield“medium yellow 35”soybean varieties in Xinjiang，and adopts the traditional extraction，enzymatic methods such as single factor experiment and double enzyme hydrolysis to obtain the functional protein.The functionality to the preparation of soybean protein，and its biochemical properties include the SDS－PAGE electrophoresis，dissolve curve，nitrogen solubility index and basic properties such as turbidity has carried on the preliminary analysis.Experiments prove that the most optimum extraction conditions for“medium yellow 35”soy protein function are that soybean water ratio is 1∶13，with pH of 8，and extracting time 2 h.The optimum technological condition:initial pH is of 3.5，with temperature of 45℃，dosage of enzyme is of 6%，and solid－to－liquid ratio is 1∶8，and extracting time 8 h.The molecular weights of two acidic proteins are 95 kD and 60 kD respectively by SDS－PAGE.

soybean;functional protein;double enzyme hydrolysis;acidic protein

TS201

A

1674－8425(2014)05－0063－04

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.05.013

2013－12－18

新疆農業大學大學生創新項目“酶解法制備大豆中黃35號酸性蛋白及在蘋果醋中的應用”(jqzyp62012154)

葛杰(1978—)，女，新疆烏魯木齊人，講師，主要從事植物抗逆分子生物學研究。

葛杰，陳虎，劉超，等.水解超高產大豆“中黃35”功能性蛋白的制備［J］.重慶理工大學學報:自然科學版，2014(5):63－66.

format:GE Jie，CHENG Hu，LIU Chao，et al.Hydrolyzed Soy Protein“Medium Yellow 35”Functional Preparation［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(5):63－66.