施陶丁格連接在生物標記中的應用

徐凡，郜炎龍，吳超柱，姜和，2

(1.重慶理工大學藥學與生物學院，重慶 400050;

2.重慶前沿生物技術有限公司，重慶 400041)

施陶丁格連接在生物標記中的應用

徐凡1，郜炎龍1，吳超柱1，姜和1，2

(1.重慶理工大學藥學與生物學院，重慶 400050;

2.重慶前沿生物技術有限公司，重慶 400041)

在生物正交反應中，疊氮化物和膦所進行的施陶丁格連接反應在各種復雜的生物系統中扮演著重要的角色，如施陶丁格連接已被用于聚糖、脂類、DNA和蛋白質的標記。此外，施陶丁格連接也作為一種合成方法用于構造糖肽類、微陣型和功能性的生物大分子。在生物正交的新興領域中，各種最新的技術通常與施陶丁格連接樹立的高標準進行比較。綜述并總結了目前施陶丁格連接的發展和在生物標記領域中的應用趨勢。

施陶丁格連接;疊氮化合物;生物正交反應;生物標記

1919 年，德國化學家赫爾曼·施陶丁格(Hermann Staudinger)首先發現并報道了疊氮化物和膦之間的反應。直到最近幾年，Bertozzi教授及其團隊發現了該反應有作為生物偶聯的潛力，并成功將其轉化為所謂的施陶丁格連接(Staudinger ligation)。多年來，一些生物合成技術比如共價鍵連接的熒光探針技術、親和標記技術，以及不同的(生物)分子同位素標記技術得到了實質的發展。通過使用不同的偶合方法，已經實現了在生理條件下的各種生物分子(如蛋白質、聚糖和DNA)的修飾、細胞表面標記和蛋白質的固定化修飾。一般情況下，建立在體外的生物偶聯策略，如硫醇馬來酰亞胺的酯偶合反應被應用于構建所需的生物化合物。但在體內環境中，大量多種類的競爭性親核物質和親電物質存在于蛋白質、聚糖和成千上萬的小的有機代謝產物上。它們在復雜的生物系統中阻礙著這種技術的應用。近幾年來，為了克服一些特異性位點技術、生物正交技術和偶聯技術在體內標記中所遇到的問題［1］，施陶丁格連接等生物偶聯技術得到了快速的發展［2－3］。在機體環境中，特異性位點的結合需要獨特的活性官能團，但體內并不存在這些所需的官能團。雖然這些獨特的生物正交反應介導所需的官能團非機體本身所攜帶，但它能在生物系統中通過高度選擇性反應和修飾得到［4］。最常采用的介導物質是用于生物正交共軛技術中的疊氮化合物［5］。疊氮化合物在生物系統內極為罕見，且其化學惰性決定了它在生理條件下的高度穩定性。理所當然的是，疊氮化合物已被用于一些生物偶聯策略，包括施陶丁格連接［6］、亞銅催化的疊氮和炔烴的環加成(CuAAC)反應［7－8］，以及近幾年出現的各種催化環加成反應如環辛炔［9－10］和dibenzocyclooctynes［11］。雖然疊氮化物在環加成反應中會產生一個穩定的三氮唑橋(見圖1)，但在施陶丁格連接中疊氮化物和膦試劑的反應會生成穩定的酰胺鍵。Saxon和Bertozzi［6］發現了施陶丁格反應在化學選擇上的潛力，就是在糖生物學中利用施陶丁格連接參與生物正交反應。他們展示了疊氮物的可修飾性，即在含聚糖的細胞表面使用熒光膦試劑進行有效標記。

Saxon和Bertozzi教授在生物標記方法中使用施陶丁格反應后發現其具有溫和性和高度選擇性，這也為其在眾多化學和生物學技術上的應用鋪平了道路。這種生物正交方式的反應被稱作施陶丁格連接。

圖1 幾種不同的物質與疊氮化物之間的反應

1 施陶丁格連接的發展

1.1 施陶丁格反應

1919 年，Staudinger和Meyer發現了疊氮化物和三苯基膦之間的反應。其中，經疊氮化物中氮原子的損失形成了膦亞胺中間體［12］。此中間體在水的存在下發生水解，生成伯胺和三苯基膦氧化物(TPPO)，如圖2所示。

圖2 膦和疊氮化物參與的經典施陶丁格反應

施陶丁格經典反應的機制已經通過各種實驗和計算方法得以徹底了解［13－14］。其中，第1步反應是反應物(6)中的磷原子對疊氮化物(5)的基團進行親核攻擊，形成中間體I疊氮膦(見圖3)。在隨后的步驟中，疊氮膦進行分子內的環化反應，形成一個四元環的過渡態(即中間結構Ⅱ)，隨著氮原子的損失，產生了膦亞胺Ⅲa和Ⅲb的共振結構。

圖3 施陶丁格反應機制

反應中，在水的存在下，膦亞胺Ⅲ將被水解生成胺(7)和穩定的氧化膦(圖3中途徑A)。該反應被稱為施陶丁格還原，且經常被使用在需要引入胺類的有機合成反應中。此外，膦亞胺中高度親核的氮原子很容易與各種親電化合物反應，得到各種有價值的中間體。例如，Staudinger和Hauser［15］首次觀察到的氮雜－Wittig反應，這是一個產生亞胺的亞氨基正膦反應(圖3中途徑B)。該反應與Wittig反應表現出了高度的相似性，使膦亞胺與醛、酮或硫酮(8)反應，以形成亞胺產物(9)。該反應最重要的應用就是發現了無環化合物和雜環化合物的合成。此外，用異(硫)氰酸酯類化合物(10)處理后的膦亞胺還可被用在碳化二亞胺的合成當中(11)，如圖3中的途徑C所示［16］。

1.2 非無痕施陶丁格連接

施陶丁格反應現被稱為施陶丁格連接，專門用來研究細胞表面代謝工程。在以前的研究中，Mahal教授［17］介紹了細胞表面工程的化學選擇性連接反應是利用酮和氨氧基或酰肼基團之間的反應。但為了達到必要的選擇性生物正交連接的標準，就需要對施陶丁格反應進行改進。在膦和疊氮化物的反應中，為了使反應平穩地進行，需要對水和室溫進行定量。最重要的是，2種反應物都需是非生物的正交介導物。但該反應產物——氮雜葉立德會經過快速的自發水解反應生成伯胺和相應的氧化膦。為了避免水解反應的發生，就需要對膦試劑進行設計，即利用分子內環化反應帶入一個分子內的親電陷阱去捕獲親核的氮雜葉立德中間體(見圖4)，經過此環化步驟后產生一個穩定的酰胺鍵(i.e.16)。在一個基于31P NMR的初步機理研究中提出:施陶丁格連接反應是經由氧膦烷中間體(17)而繼續進行的(圖4)［18］。然而，最近有報道對該反應的不同機制進行了探索，分析了中間體結構(14)中所涉及的關鍵步驟(基于1H NMR，2D1H和13C NMR光譜，以及X－射線結晶)，得出的結論是氧化膦中的氧原子來自于水分子［19］。

圖4 施陶丁格連接機制

1.3 無痕施陶丁格連接

在非無痕施陶丁格連接公布后不久，Raines等［20］和Bertozzi等［23］同時報道了所謂的無痕施陶丁格連接。該變型與非無痕施陶丁格連接的區別是:在最終的水解步驟中，產物消除了氧化膦。Raines等［22］通過研究證明:需要共軛的2個肽片段可通過無痕施陶丁格連接代替原有的化學連接方法。在他們的研究中，2－(二苯基膦)－苯硫醇(19)和(二苯基膦)甲硫醇(20)分別作為該連接的硫酯和疊氮化物的輔助反應物［20，22］。在該反應的第一步中，硫酯(18)在膦硫醇(19或20)的條件下進行轉硫酯化;然后被激活的硫酯(21)與疊氮化物(22)反應形成膦亞胺(23);后經分子內重排形成氨基磷酸鹽(24)，經水解得到酰胺(25)(圖5)。此外，試劑(20)在反應中的高速率和高度化學選擇性，使之成為介導施陶丁格連接最有效的偶合試劑。

圖5 以硫醇為反應輔助物的無痕施陶丁格連接

由Saxon等［21］描述的無痕施陶丁格連接方法在實施過程中可設計不同的膦酰化化合物，通過不同的聯動系統進行切割以形成酰胺鍵，如圖6 (a)所示。在這些化合物的反應中，決定一個結構性的先決條件是需要在2個芳香膦取代基的存在下進行反應，以防止膦的過度氧化。在一個模型反應中，把4種酰基膦試劑(26a～d)用疊氮核苷(27)進行處理后，化合物26a和26b都得到了較高收率的施陶丁格連接產物，而化合物26c和26d只得到了氮雜內鎓鹽水解產物，如圖6(b)所示。

圖6 無痕施陶丁格連接方法

2 施陶丁格連接在生物標記中的應用

在化學生物學中，用于研究生物系統最重要的方法之一就是把小分子結合到生物分子上。而施陶丁格連接就是一種有效的偶合策略，已被廣泛應用于生物分子中化學探針的偶合。在生物分子內使用施陶丁格連接作為生物偶聯的方法需要在膦或疊氮化物的存在下進行反應，而疊氮化物的分子大小和在生理條件下的穩定性使其可作為反應物的首要選擇。另外，部分疊氮基可以很容易地通過化學方法(如重氮基轉移)或者生物合成的基本途徑結合于糖鏈、蛋白質、脂質和DNA上。以下主要是對施陶丁格連接在不同的生物分子中作為標記試劑的方法進行討論。

2.1 聚糖標記

分子成像技術使機體環境中的生物分子可視化且避免了大量的干擾。聚糖的體內成像觀察是非常有趣的，因為這些生物聚合物參與了許多的生物變化過程，包括細胞間的相互作用、分子轉運、信號轉導和內吞作用［23－24］。現有的分子生物學技術應用于蛋白質和DNA的分析和成像技術，但還不能應用于研究聚糖，因為聚糖在基因組中不直接參與編碼。雖然聚糖可通過外源凝集素和抗體的作用成像，但在體內使用這些檢測方法受到了其低親和力特性的限制［25］。用于聚糖成像的另一種方法就是利用席夫堿與醛或酮所形成的結構。但這個方法也會產生問題，即聚糖會非特異性地結合于體內的內源性代謝物［4，17］。在聚糖成像領域取得突破的是Saxon和Bertozzi［6］。他們利用修飾后的疊氮化甘露糖的衍生物，即N－疊氮乙酰甘露糖胺(30)作為生物正交介導物來實現聚糖成像。Jurkat細胞與單糖(30)的培養導致該化合物通過唾液酸的生物合成途徑(圖7)引入聚糖［26］。引入的ManNAz單元隨后被可視化為膦－生物素探針(38，圖9)進行施陶丁格連接。在生物素標記的糖鏈被用熒光標記的抗生素蛋白處理后，該復合體就能在熒光下被觀測到。

圖7 通過生物合成方式將疊氮化糖類引入糖綴合中的反應機理

另外，像大分子的類似物如N－乙酰甘露糖胺等都不能或只能極少地整合。事實證明，在生物合成過程中，整合的過程受阻于由ManNAc 6－激酶所產生ManNAc衍生物的較差轉化［27］。為了克服這個特定的酶促步驟，對其引入了唾液酸的衍生物(32)，它能有效地被傳遞到細胞表面［28］。在隨后的研究中，Bertozzi等對小鼠的脾細胞進行了施陶丁格連接實驗。他們對小鼠注射糖(30)后產生了被疊氮化物標記的脾細胞。具體步驟就是在第二步中(不包括體外)用FLAG化合物(37)進行施陶丁格連接(圖9)，然后經流式細胞儀進行分析檢測［29］。在監測細胞表面標記或用于蛋白質組的分析中，雖然FLAG－膦綴合物(37)和生物素－膦綴合物(38)均可作為合適的探針，但其不適用于聚糖的體內成像。在生命系統中，有熒光標記功能的膦探針被應用于對聚糖的可視化觀察。綴合物Cy5－膦(39)在熒光素－膦(40)和羅丹明－膦(41)中，由于其低熒光背景的顯示特征被證明是優良的膦探針熒光標記物。綴合物Cy5－膦(39)的低熒光背景效應歸因于其較高的電荷密度，因此具有較大的溶解度，能更有效地去除過量的膦綴合物［30］。

圖8 疊氮官能類似物引入自然單糖的生物合成途徑

此外，通過對聚糖使用疊氮糖代謝標記和膦修飾的熒光成像探針的可視化觀察，Bertozzi等［31］應用熒光素－膦綴合物(42)的生物發光對細胞表面的聚糖進行檢測，并對該熒光素－膦綴合物與含疊氮基的聚糖進行施陶丁格連接，游離的熒光素擴散到由熒光素酶轉化為能產生生物光的氧化熒光素的細胞中。

圖9 各種三芳基膦的結合物分子結構

2.2 蛋白質標記

用于蛋白質標記的施陶丁格連接的一個關鍵要求是特定的蛋白質能與膦或疊氮化物標記功能化。該反應優先選擇疊氮化物，因為在水溶液中的膦部分在化學處理過程中氧化程度較高;而疊氮化物則可以通過化學方法引入到蛋白質中，也就是通過重氮基轉移反應或生物化學反應［32］，以及通過使用基因工程為蛋白質引入含疊氮基的氨基酸或通過翻譯進行修飾［33－34］。

2.2.1 非天然氨基酸標記

通過細胞翻譯機制，可以利用體外(即在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞)任意一個位點特異性或殘基位置特異性來實現氨基酸類似物的引入。這種引入是受到氨酰基－tRNA合成酶(aaRS)最嚴格的控制。這些酶負責氨基酸到tRNA的偶合。例如，蛋氨酸的結構類似物(見圖10)可以通過甲硫氨酰－tRNA合成酶(MetRS)以殘基位置特異性的方式引入到蛋白質中。

圖10 蛋氨酸類似物通過MetRS引入蛋白質中的反應機理

2.2.2 蛋白修飾酶標記

利用施陶丁格連接進行蛋白質位點選擇性標記的另一種方法是在使用蛋白質修飾酶的基礎上進行翻譯后修飾。含疊氮化物的標記通過能識別一個特定的氨基酸序列的蛋白質修飾酶共價偶聯于靶蛋白上。Ting等［35］利用從古細菌P.horikoshii提取出的生物素連接酶去位點選擇性地將疊氮化生物素類似物(46)和內源性生物素蛋白質進行連接(eBAP)。在疊氮化生物素類似物與蛋白進行酶促偶聯后，利用施陶丁格連接形成三芳基膦－FLAG綴合物(37，見圖11)，最后所得的產物用anti－FLAG抗體進行免疫印跡檢測。

圖11 翻譯后修飾的eBAP被FLAG－膦(37)標記并帶有疊氮化生物素類似物(46)的反應機理

3 結束語

目前，生物正交偶合技術已廣泛應用于系統生物學中，并且在化學中的影響正迅速擴大。此外，新的偶合策略允許對以前不能用現有技術研究的復雜生物目標進行修改。施陶丁格連接目前在原生環境中已被證明特別適用于生物分子的標記。除了可作為有效的標識試劑外，施陶丁格連接已經被證明是一個能在多肽類、糖肽類和糖蛋白的表面結構進行精確修飾的方法。但是，所有的生物正交反應都是通過引入非天然的介導物對生物分子進行修改，雖然對于機體本身來說是極小的變化，但機體的原生環境可能會影響生物分子的結構、活性和穩定性。因此，尋求一種不依賴疊氮基作為介導的生物正交技術仍然是一個持續的挑戰。

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(責任編輯 何杰玲)

Application of the Staudinger Ligation in Bio-labeling

XU Fan1，GAO Yan－long1，WU Chao－zhu1，JIANG He1，2
(1.School of Pharmacy and Bioengineering，
Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China; 2.Chongqing Frontier Biotechnologies Co.，Chongqing 400041，China)

In bio－orthogonal reaction，the azide and the phosphine functions has resulted in the Staudinger ligation playing an important role in a variety of complex biological systems.For instance，the Staudinger ligation has been used for labeling glycans，lipids，DNA，and proteins.Moreover，the Staudinger ligation method is used to construct glycopeptides，microarrays，and functional biopolymers.In the emerging field of bio－orthogonal，the Staudinger ligation has set a high standard to which most of the new techniques are often compared.This review summarizes recent developments of the Staudinger ligation and its application trends in the field of biological labeling.

Staudinger ligation;the azide;bio－orthogonal reaction;bio－labeling

O643

A

1674－8425(2014)05－0067－07

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.05.014

2013－10－27

重慶市科技攻關項目(Cstc2011ggC10003－29)

徐凡(1987—)，男，重慶人，碩士研究生，主要從事新藥研發與多肽合成研究。

徐凡，郜炎龍，吳超柱，等.施陶丁格連接在生物標記中的應用［J］.重慶理工大學學報:自然科學版，2014 (5):67－73.

format:XU Fan，GAO Yan－long，WU Chao－zhu，et al.Application of the Staudinger Ligation in Bio－labeling［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(5):67－73.