單寧酸對(duì)高糖和糖化終末產(chǎn)物培養(yǎng)條件下腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及微炎癥狀態(tài)的改善作用

魏海峰,李 才,方艷秋,魏雁虹,譚 巖

(1.吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130021; 3.吉林省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,吉林長(zhǎng)春 130021)

單寧酸對(duì)高糖和糖化終末產(chǎn)物培養(yǎng)條件下腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及微炎癥狀態(tài)的改善作用

魏海峰1,李 才2,方艷秋1,魏雁虹3,譚 巖1

(1.吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130021; 3.吉林省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,吉林長(zhǎng)春 130021)

目的:探討單寧酸對(duì)腎小球系膜細(xì)胞(GMC)的作用,從氧化應(yīng)激及微炎癥角度闡明單寧酸改善糖尿病腎病(DN)的作用機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)GMC,分別用高濃度葡萄糖(30 mmol·L－1)及糖化終末產(chǎn)物(AGEs)牛血清白蛋白(BSA,250 mg·L－1)處理,正常糖培養(yǎng)及不含糖的BSA處理的細(xì)胞作為相應(yīng)對(duì)照組,在高糖或AGEs處理的同時(shí)采用不同濃度單寧酸(10、20、40和80μmol·L－1)進(jìn)行干預(yù),培養(yǎng)48 h后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中丙二醛(MDA)水平及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性, ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHd G)水平,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GMC中細(xì)胞間黏附分子1 (ICAM-1)蛋白表達(dá),RT-PCR法檢測(cè)GMC中單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)和ICAM-1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果:與高糖組和AGEs組比較,單寧酸處理組MDA水平明顯降低(P＜0.05),GSH-Px、SOD及CAT活性明顯升高(P＜0.05或P＜0.01),GMC培養(yǎng)上清中8-OHd G水平明顯降低(P＜0.05)。與高糖組和AGEs組比較, 40和80μmol·L－1單寧酸組ICAM-1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。與高糖組比較,單寧酸組MCP-1和ICAM-1 m RNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。結(jié)論:單寧酸可保護(hù)GMC免受氧化及炎癥介質(zhì)的損傷,從而延緩和改善DN的腎小球病變。

單寧酸;糖尿病腎病;氧化應(yīng)激;微炎癥;8-羥基脫氧鳥苷

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一。DM可通過(guò)多種途徑損害腎臟,并累及腎臟的所有結(jié)構(gòu),包括腎小球、腎小管、腎血管及間質(zhì)等,但DN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,也缺乏有效的治療方法。單寧酸(tannic acid,TA)具有止血愈傷、抑菌、抗病毒、抗炎、抗氧化和延緩衰老等功效[1]。我國(guó)擁有豐富的提取制備單寧酸的天然資源,約70%以上的中草藥、多種樹木及果實(shí)中均含有此類鞣質(zhì)化合物。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于單寧酸對(duì)DN防治作用的研究少有報(bào)道。本文作者前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[9]結(jié)果表明:單寧酸可以降低DM大鼠血清肌酐和尿素氮,減少DM大鼠尿蛋白排泄率,減輕腎小球系膜基質(zhì)增生和基底膜增厚,對(duì)腎臟功能具有一定保護(hù)作用[2]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells,GMC),觀察單寧酸對(duì)高糖和糖化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end-products,AGEs)培養(yǎng)條件下GMC氧化應(yīng)激水平及炎癥因子表達(dá)的影響,在細(xì)胞水平探討單寧酸改善腎臟病變的作用機(jī)制,為單寧酸防治DN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑大鼠GMC(吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存),單寧酸和牛血清白蛋白(BSA組分Ⅴ)和鹽酸氨基胍(美國(guó)Sigma公司),DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司),小牛血清(FBS,天津?yàn)蠊?,丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒(南京建成公司),大鼠8-羥基脫氧鳥苷(8-OHd G)試劑盒(美國(guó)R&D公司),兔抗大鼠細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)多克隆抗體(北京博奧森公司),過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢博士德公司)。

1.2 AGEs-BSA的制備 將10 g·L－1BSA、0.5 mol·L－1葡萄糖、1 mmol·L－1EDTA、100 IU·m L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素溶于0.1 mol·L－1PBS(p H 7.2),過(guò)濾除菌,37℃恒溫避光孵育2個(gè)月,以相對(duì)分子質(zhì)量為10 000的透析袋對(duì)PBS溶液充分透析,以除去未結(jié)合的葡萄糖。同樣條件下用不含葡萄糖BSA孵育的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組大鼠GMC在低糖條件下培養(yǎng)后分為以下各組:正常糖(normal glucose,NG)組,含5.6 mmol·L－1D-葡萄糖;高糖(high glucose,HG)組,含30 mmol·L－1D-葡萄糖;甘露醇組,含25 mmol·L－1甘露醇; AGEs及BSA組:將AGEs或BSA加入低糖DMEM培養(yǎng)液中,使AGEs及BSA終濃度為250 mg·L－1;藥物處理組:在高糖或AGEs處理的同時(shí)加入藥物,單寧酸分為10、20、40和80μmol·L－14個(gè)濃度組;氨基胍(AG)作為陽(yáng)性對(duì)照藥,終濃度為250μmol·L－1。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA、8-OHdG水平及GSH-Px、SOD和CAT活性檢測(cè)細(xì)胞給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清,采用比色法及酶法檢測(cè)MDA水平及GSH-Px、SOD和CAT活性。采用ELISA法檢測(cè)8-OHd G水平,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ICAM-1蛋白表達(dá)細(xì)胞爬片,培養(yǎng)48 h后用PBS(0.1 mol·L－1, p H 7.4)洗板3次,將玻片用10%甲醛固定30 min。免疫組織化學(xué)染色采用SABC法,應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)陽(yáng)性率。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-1)和ICAM-1 m RNA表達(dá)水平按照Trizol說(shuō)明書,提取細(xì)胞總RNA。參照AMV Reverse transcriptase說(shuō)明方法,取總RNA 2μg, Oligo(d T)為引物,合成cDNA第1條鏈。設(shè)計(jì)引物由上海生工合成完成。擴(kuò)增GAPDH (BC004109):5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′,5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′,擴(kuò)增片段617 bp;MCP-1 (M57441.1):5′-CAATGAGTCGGCTGGAGA-3′,5′-GCTTGAGGTGGTTGTGGA-3′,擴(kuò)增片段281 bp;ICAM-1(NM_010493.2):5′-CGTGCTGTATGGTCCTCG-3′,5′-GGGCTTGTCCCTTGAGTT-3′,擴(kuò)增片段423 bp。反應(yīng)條件: 94℃變性5 min;94℃變性45 s,58℃退火45 s, 72℃延伸45 s,共30個(gè)循環(huán);72℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析,紫外線透射反射分析儀上拍照,應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算待檢基因與GAPDH的灰度比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。培養(yǎng)上清中MDA和8-OHdG水平, GSH-Px、SOD和CAT活性,細(xì)胞中ICAM-1蛋白、MCP-1和ICAM-1 mRNA表達(dá)水平以±s表示,多組間樣本均數(shù)比較用方差分析,兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 高糖培養(yǎng)的GMC培養(yǎng)上清中MDA水平和GSH-Px、SOD及CAT活性高糖條件培養(yǎng)GMC 48 h,與正常糖組比較,高糖組細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA水平明顯升高(P＜0.05),GSH-Px、SOD 和CAT活性明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。與高糖組比較,40和80μmol·L－1單寧酸處理組MDA水平明顯降低(P＜0.05),不同濃度單寧酸處理組GSH-Px、SOD和CAT活性明顯升高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 高糖培養(yǎng)的GMC培養(yǎng)上清中MDA水平和GSH-Px、SOD及CAT活性Tab.1 Levels of MDA and activities of GSH-Px,SOD and CAT in GMC supernatant cultured with high glucose (n＝5,±s)

表1 高糖培養(yǎng)的GMC培養(yǎng)上清中MDA水平和GSH-Px、SOD及CAT活性Tab.1 Levels of MDA and activities of GSH-Px,SOD and CAT in GMC supernatant cultured with high glucose (n＝5,±s)

?P＜0.05,??P＜0.01 vs NG group;△P＜0.05 vs HG group.

Group Drug dose (μmol·L－1) MDA [cB/(μmol·L－1)] GSH-Px [λB/(U·m L－1] SOD [λB/(U·m L－1] CAT [λB/(U·m L－1] NG 0 9.45±5.83 139.12±25.03 17.74±1.72 2.55±0.40 HG 0 20.31±8.78?100.34±15.61?14.15±2.06??1.73±0.29??HG＋AG 250 10.90±5.34△130.52±26.25 16.70±1.97△1.99±0.31 HG＋TA 10 14.98±8.74 132.42±30.76 16.97±1.48△2.21±0.51 20 15.69±9.06 125.02±41.14 16.51±2.56 2.30±0.48△40 9.53±5.26△136.64±26.09△17.22±1.93△2.27±0.45 80 10.57±4.97△139.77±22.81△16.97±1.86△2.38±0.53△

2.2 AGEs處理的GMC培養(yǎng)上清中MDA水平和GSH-Px、SOD及CAT活性與BSA組比較, AGEs組GSH-Px、SOD和CAT活性顯著降低(P＜0.05或P＜0.01),MDA水平明顯升高(P＜0.01)。與AGEs組比較,單寧酸處理組GSH-Px、SOD和CAT活性明顯升高(P＜0.05或P＜0.01),MDA水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),且呈濃度依賴效應(yīng),以80μmol·L－1單寧酸效果最為顯著。見(jiàn)表2。

2.3 高糖培養(yǎng)的GMC培養(yǎng)上清中8-OHdG水平正常糖組8-OHdG水平較低,高糖組8-OHdG水平較正常糖組明顯升高(P＜0.01);氨基胍及單寧酸組8-OHd G水平較高糖組有所降低,其中80μmol·L－1單寧酸組8-OHdG水平明顯降低,與高糖組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 AGEs處理的GMC培養(yǎng)上清中8-OHd G水平BSA組8-OHdG水平較低,AGEs組8-OHdG水平較BAS組明顯升高(P＜0.01);與AGEs組比較,氨基胍及40、80μmol·L－1單寧酸組8-OHdG水平均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),見(jiàn)表4。單寧酸可減少AGEs引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激增加,且這種作用呈一定濃度依賴性。

表2 AGEs處理的GMC培養(yǎng)上清中MDA水平和GSH-Px、SOD及CAT活性Tab.2 Levels of MDA and activities of GSH-Px,SOD and CAT in GMC supernatant treated with AGEs (n＝5,±s)

表2 AGEs處理的GMC培養(yǎng)上清中MDA水平和GSH-Px、SOD及CAT活性Tab.2 Levels of MDA and activities of GSH-Px,SOD and CAT in GMC supernatant treated with AGEs (n＝5,±s)

?P＜0.05,??P＜0.01 vs BSA group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs AGEs group.

Group Drug dose (μmol·L－1) MDA [λB/(U·m L－1)] GSH-Px [λB/(U·m L－1)] SOD [λB/(U·m L－1)] CAT [λB/(U·m L－1)] BSA 0 11.60±4.62 115.53±19.84 25.43±6.87 2.39±0.32 AGEs 0 25.13±11.06??85.93±8.82?15.39±3.77?1.54±0.44??AGEs＋AG 250 12.93±5.66△109.33±20.63 23.84±7.18△2.05±0.37△AGEs＋TA 10 15.22±9.08△107.55±20.75 21.23±6.03 1.97±0.30 20 13.13±6.22△111.73±30.30 23.00±5.37 2.11±0.34△40 12.67±5.95△△115.93±21.40△24.11±6.20△2.16±0.50△80 11.97±5.36△△114.29±23.44△27.69±6.96△△2.20±0.24△△

表3 高糖培養(yǎng)的GMC培養(yǎng)上清中8-OHdG水平Tab.3 Levels of 8-OHdG in GMC supernatant cultured with high glucose[n＝3,±s,ρB/(ng·L－1)]

表3 高糖培養(yǎng)的GMC培養(yǎng)上清中8-OHdG水平Tab.3 Levels of 8-OHdG in GMC supernatant cultured with high glucose[n＝3,±s,ρB/(ng·L－1)]

?P＜0.05,??P＜0.01 vs NG group;△P＜0.05 vs HG group.

?

表4 AGEs處理的GMC培養(yǎng)上清中8-OHd G水平Tab.4 Levels of 8-OHd G in GMC supernatant treated with AGEs[n＝3,±s,ρB/(ng·L－1)]

表4 AGEs處理的GMC培養(yǎng)上清中8-OHd G水平Tab.4 Levels of 8-OHd G in GMC supernatant treated with AGEs[n＝3,±s,ρB/(ng·L－1)]

?P＜0.05,??P＜0.01 vs BSA group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs AGEs group.

Group Drug dose (μmol·L－1)8-OHdG BSA 0 47.57±2.41 AGEs 0 61.97±6.99??AGEs＋AG 250 53.88±3.25△AGEs＋TA 10 57.43±3.02??20 55.79±2.78?40 52.81±3.23△80 52.44±3.58△△

2.5 高糖培養(yǎng)的GMC中ICAM-1蛋白表達(dá)水平高糖可明顯刺激GMC中ICAM-1蛋白表達(dá),單寧酸可降低GMC中ICAM-1蛋白表達(dá)。采用病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白陽(yáng)性表達(dá)率統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示:40和80μmol·L－1單寧酸組ICAM-1表達(dá)水平(38.47%±10.13%和29.11%±8.74%)較高糖組(82.14%±14.43%)明顯減少(P＜0.05)。見(jiàn)圖1(插頁(yè)四)。

2.6 AGEs處理的GMC中ICAM-1蛋白表達(dá)水平AGEs可刺激GMC中ICAM-1蛋白表達(dá),40和80μmol·L－1單寧酸組ICAM-1表達(dá)水平(43.47%±12.56%和32.28%±10.17%)較AGEs組(79.62%±15.43%)明顯減少(P＜0.05)。見(jiàn)圖2(插頁(yè)四)。

2.7 高糖培養(yǎng)的GMC中MCP-1和ICAM-1 m RNA表達(dá)水平高糖刺激GMC 48 h,MCP-1 和ICAM-1 m RNA表達(dá)水平均明顯高于正常糖組(P＜0.01)。40和80μmol·L－1單寧酸組MCP-1 m RNA表達(dá)水平明顯低于高糖組(P＜0.05或P＜0.01);單寧酸組ICAM-1 mRNA表達(dá)水平低于高糖組(P＜0.01)。單寧酸以劑量依賴方式降低高糖誘導(dǎo)的GMC中MCP-1及ICAM-1基因轉(zhuǎn)錄水平。見(jiàn)表5和圖3。

表5 各組GMC中MCP-1和ICAM-1 m RNA表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of MCP-1 and ICAM-1 m RNA in GMC in various groups(n＝3,±s)

表5 各組GMC中MCP-1和ICAM-1 m RNA表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of MCP-1 and ICAM-1 m RNA in GMC in various groups(n＝3,±s)

?P＜0.05,??P＜0.01 vs NG group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs HG group.

Group Drug dose (μmol·L－1)MCP-1/GAPDH ICAM-1/GAPDH NG 0 0.27±0.03 0.72±0.07 HG 0 0.47±0.04??1.16±0.12??HG＋AG 250 0.36±0.09△0.97±0.07??△HG＋TA 10 0.39±0.06?0.96±0.13??△△20 0.40±0.08?0.87±0.05?△△40 0.35±0.05△0.86±0.02△△80 0.32±0.03△△0.84±0.03△△

3 討論

圖3 各組GMC中MCP-1和ICAM-1 m RNA表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of MCP-1 and ICAM-1 mRNA in GMC in various groupsM:DNA marker DL 2000;Lane 1:NG group;Lane 2:HG group; Lane 3:HG＋AG group;Lane 4－7:HG＋TA groups(10,20,40, and 80μmol·L－1).

GMC是腎小球中功能最活躍的固有細(xì)胞,功能極其復(fù)雜,在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-4]。在多種因素作用下,GMC可發(fā)生異常增殖,同時(shí)伴有細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的增多、細(xì)胞因子分泌及各種炎癥因子受體的表達(dá),最終導(dǎo)致腎小球硬化,GMC是研究腎小球疾病發(fā)病機(jī)制的一種重要靶細(xì)胞。高血糖是引起DN的始動(dòng)因素,持續(xù)高血糖狀態(tài)下體內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)和最后形成AGEs是DN的重要發(fā)病機(jī)制[5-6]。此外,DM時(shí)高糖誘導(dǎo)或通過(guò)非酶糖基化及脂質(zhì)過(guò)氧化等過(guò)程可導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增加,抗氧化防御體系減弱也會(huì)使ROS大量生成。ROS可干擾正常葡萄糖代謝、參與DM腎小球血流動(dòng)力學(xué)變化,使腎組織內(nèi)ECM代謝紊亂,并參與ECM降解酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[7]。此外,ROS與細(xì)胞跨膜信號(hào)通路、腎組織炎癥和足細(xì)胞損傷密切相關(guān)[8-9]。

本研究前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10]結(jié)果表明:單寧酸處理的DM大鼠較模型組大鼠腎組織及血清抗氧化酶活性顯著升高,MDA水平下降,提示單寧酸能提高DM大鼠體內(nèi)抗氧化能力,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),調(diào)整體內(nèi)氧自由基代謝紊亂狀態(tài)。在體外實(shí)驗(yàn)中,用高糖及AGEs刺激培養(yǎng)GMC發(fā)現(xiàn):單寧酸可抑制高糖及AGEs刺激引起的GMC增殖及Ⅳ型膠原生成[11]。為了進(jìn)一步探討其作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA水平和抗氧化酶(SOD、GSH-px及CAT)的活力,并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中8-OHdG水平,用以衡量細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:高糖及AGEs刺激GMC 48 h后,培養(yǎng)上清中MDA水平增加,抗氧化酶活力明顯降低,提示高糖及AGEs均可以使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。同時(shí),在培養(yǎng)上中清檢測(cè)到較高水平8-OHdG,提示在高糖及AGEs刺激作用下,GMC存在細(xì)胞核DNA或線粒體DNA的氧化損傷。在上述2種條件下,單寧酸均可有效提升抗氧化酶活力,減少M(fèi)DA生成,單寧酸處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清8-OHdG水平也有所減少。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)單寧酸可減少由高糖及AGEs引起的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增加,表明單寧酸具有明顯的抗氧化活性。分析原因可能是因?yàn)閱螌幩崾且环N多元酚結(jié)構(gòu)化合物,其特點(diǎn)是含有較多的苯羥基,具有很強(qiáng)的供氫能力,能清除氧自由基達(dá)到抗氧化作用。Quagliaro等[12]研究提示:8-OHdG可以改變絲裂原活化蛋白激酶通路,促進(jìn)細(xì)胞凋亡及DNA氧化應(yīng)激損傷,這些效應(yīng)促進(jìn)DM并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。單寧酸可以減少8-OHd G生成,防止細(xì)胞DNA損傷,進(jìn)而延緩DN的進(jìn)程及改善腎臟免受氧化損傷。

一般認(rèn)為:DN是由于長(zhǎng)期代謝異常引起的繼發(fā)性疾病,并非一種免疫性疾病,故很少?gòu)难装Y角度對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。然而炎癥介質(zhì)在DN的發(fā)病中可能起重要的作用[13]。ICAM-1是由細(xì)胞產(chǎn)生的介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間或細(xì)胞與基質(zhì)之間相互作用的一類膜表面糖蛋白分子。在正常情況下,腎小球內(nèi)不表達(dá)或低表達(dá)ICAM-1。ICAM-1高表達(dá)可促使單核巨噬細(xì)胞在腎臟浸潤(rùn),其表達(dá)增加的水平與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度相平行。浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞釋放各種炎性因子如IL-1和TGF-β等,進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),導(dǎo)致ECM產(chǎn)生增多和降解減少,參與腎小球硬化的發(fā)生過(guò)程[14]。MCP-1是一種對(duì)單核細(xì)胞有特異趨化作用的炎癥細(xì)胞因子,能特異性地趨化激活單核巨噬細(xì)胞,是炎癥趨化因子超家族中的成員之一,而炎癥趨化因子超家族在炎癥中發(fā)揮中心作用[15]。本研究結(jié)果顯示:高糖及AGEs可誘導(dǎo)GMC表達(dá)過(guò)量ICAM-1,并增加GMC中MCP-1及ICAM-1基因轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)一步提示炎癥介質(zhì)表達(dá)增加在促進(jìn)GMC活化、增殖及ECM積聚,進(jìn)而引起腎小球硬化方面可能起重要作用。單寧酸是從多種樹木、果實(shí)及中藥中提取的一種具有廣泛藥理活性的化合物,具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和調(diào)節(jié)糖脂代謝等作用[16-17]。單寧酸能減少GMC中ICAM-1蛋白表達(dá)并下調(diào)MCP-1和ICAM-1基因轉(zhuǎn)錄水平,減少炎癥介質(zhì)對(duì)GMC的損傷,從而起到保護(hù)GMC的作用。

綜上所述,單寧酸可改變GMC的生物學(xué)行為,保護(hù)GMC免受氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)的損傷,減少ECM合成,促使系膜基質(zhì)代謝處于穩(wěn)態(tài),這可能是單寧酸改善DN腎小球病變所起的關(guān)鍵作用。本研究在細(xì)胞水平為單寧酸有效防治DN提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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Ameliorating effect of tannic acid on high glucose or AGEs induced oxidative stress and micro-inflammatory state in glomerular mesangial cells

WEI Hai-feng1,LI Cai2,FANG Yan-qiu1,WEI Yan-hong3,TAN Yan1
(1.Central Laboratory,People’s Hospital,Jilin Province,Changchun 130021,China; 2.Institute for Translational Medicine,Jilin University,Changchun 130021,China; 3.Department of Laboratory,People’s Hospital,Jilin Province,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo investigate the effect of tannic acid on glomerular mesangial cells(GMC),and to clarify the mechanism of tannic acid in improving the pathological changes of diabetic nephropathy(DN)from the aspect of oxidative stress and micro-inflammation.Methods The glomerular mesangial cells were treated with glucose (30 mmol·L－1)or advanced glycosylation end-products(AGEs)bovine serum albumin(BSA)(250 mg·L－1)and then different concentrations of tannic acid(10,20,40 and 80μmol·L－1)were added into the GMC.The cellscultured by normal glucose or treated with BSA were used as control groups and then the level of malonic dialdehyde (MDA),glutathione peroxidase(GSH-Px),superoxide Dismutase(SOD),CAT(Catalase)activities and 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine(8-OHd G)levels in the culture supernatant 48 h after culture were determined by colorimetry and ELISA method.The expressions of intercellular cell adhesion molecule-1(ICAM-1)protein, monocyte chemotactic protein 1(MCP-1)and ICAM-1 m RNA in GMC were detected by immunohistochemical staining and RT-PCR method.ResultsCompared with high glucose and AGEs groups,the MDA levels in tannic acid groups were reduced significantly(P＜0.05);the activities of GSH-Px,SOD and CAT were increased significantly(P＜0.05 or P＜0.01);the 8-OHd G levels in annic acid groups were significantly reduced(P＜0.05).Compared with high glucose and AGEs groups,the expressions levels of ICAM-1 protein in 40 and 80μmol·L－1tannic acid groups were decreased(P＜0.05).The m RNA expressions levels of MCP-1 and ICAM-1 were significantly lower than those in high glucose group(P＜0.01).ConclusionTannic acid could protect GMC against the damage of oxidative and inflammatory mediators,thereby delaying and improving the glomerular lesions of DN.

tannic acid;diabetic nephropathy;oxidative stress;micro-inflammation;8-hydroxy-2＇-deoxyguanosine

R-332;R587.1

A

2013-11-14

吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目資助課題(20122113)

魏海峰(1978－),男,吉林省長(zhǎng)春市人,醫(yī)學(xué)博士,主要從事糖尿病及腫瘤分子病理學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究。

譚 巖(Tel:0431-85595141,E-mail:tanyan49＠hotmail.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-1007-06

10.13481/j.1671-587x.20140520