鋅指蛋白185對人膠質瘤細胞遷移的影響*

陸 斌 鄭全輝

鋅指蛋白185對人膠質瘤細胞遷移的影響*

陸 斌①鄭全輝②

目的：探討鋅指蛋白185（zinc finger protein 185，ZNF185）在人膠質瘤細胞遷移中的作用。方法：Western blot檢測ZNF185在神經膠質瘤及瘤旁正常組織的蛋白表達，克隆ZNF185基因轉染人膠質瘤細胞，免疫熒光染色檢測ZNF185的細胞定位，細胞劃線和Transwell小室法檢測ZNF185蛋白對細胞遷移的影響。結果：與瘤旁正常腦組織相比，ZNF185在人膠質瘤組織和細胞系中的表達顯著降低；ZNF185蛋白主要分布于人膠質瘤細胞的細胞質、細胞膜，并與肌動蛋白纖維共定位；過表達ZNF185顯著抑制人膠質瘤細胞的遷移。結論：ZNF185通過結合肌動蛋白纖維發揮抑制人膠質瘤細胞遷移的作用。

鋅指蛋白 神經膠質瘤 細胞遷移

膠質瘤是神經系統最常見的原發性腫瘤，嚴重危害人類健康。惡性腦膠質瘤形成的早期具有較強的侵襲和彌散能力，即使手術全切瘤組織后，仍不能避免其在術腔邊緣復發。目前對膠質瘤發生和發展的分子機制仍缺乏深入了解。近年分子遺傳學研究表明，多種與細胞增殖、分化相關基因的表達異常在膠質細胞瘤的發生、發展過程中發揮重要作用［1-2］。鋅指蛋白185（zinc finger protein 185，ZNF185）是一種c端含有LIM（Lin-1、Is1.1和nec-3）結構域的蛋白，其編碼基因包括腦部在內的人體多種組織中表達，并發揮廣泛的抑癌基因作用［3-5］。然而，對于ZNF185是否在人腦膠質細胞瘤的發生、發展過程中發揮作用尚不明確。本研究檢測ZNF185在人腦膠質瘤和瘤旁正常組織的表達差異，探討其在膠質瘤細胞中的細胞定位和對細胞遷移的影響，以期為深入了解膠質細胞瘤的發生和發展機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦膠質細胞瘤及瘤旁正常組織取自32例自2008年1月至2014年1月于唐山市工人醫院就診，經病理確診為膠質瘤患者的凍存組織標本。其中男性20例，女性12例，年齡15～67歲，中位年齡38.5歲。人膠質瘤細胞系SF767由本實驗室凍存。DMEM細胞培養液、胎牛血清（FBS）購自美國GIBCO公司；TRIzol試劑盒、Lipofactamine 2000購自美國Invitrogen公司；各種限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶和反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自美國Axygen公司；兔抗人ZNF185一抗、兔抗人actin一抗、HRP羊抗兔二抗購自北京博奧森公司。pEGFPC2綠色熒光蛋白表達質粒由中國科學院動物研究所趙勇研究員提供；蛋白提取試劑盒和Bio-Rad蛋白濃度測定試劑盒購自北京天恩澤公司，引物由上海生物工程服務公司合成。氨基糖苷類抗生素G418、Hoechst、Phalloidin-TRITC購自Sigma公司。Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 Western blot分別混合人腦膠質細胞瘤和瘤旁正常組織（5例/組），提取組織蛋白及膠質瘤細胞系SF767總蛋白，測定蛋白濃度。各取10 μg進行SDS-PAGE膠電泳。電泳后將蛋白電轉（4℃、恒流300 mA、2 h）至硝酸纖維素膜（NC）上，然后將NC膜在含100 g/L脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h，加兔抗人ZNF185一抗（1∶1 000）4℃過夜，TBST洗去未結合一抗，再加HRP羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫作用1 h，TBST沖洗后加底物反應3 min，暗室曝光。

1.2.2 ZNF185 cDNA克隆 瘤旁正常組織總RNA提取和反轉錄按照試劑盒說明書進行。PCR采用Pfx高保真DNA聚合酶和下列引物：上游：5'-GGAATTCA TGAGTATCTCAGCTCTTG-3'；下游：5'-ACGCGTCG ACTAGAAGAGCTTCTCATAGC-3'。上、下游引物分別加入EcoRI/SalI酶切位點。反應條件：94℃2 min，然后94℃30 s，58℃45 s，72℃延伸1 min；30個循環，最后72℃孵育10 min，PCR產物膠回收并純化。EcoRI/SalI雙酶切PCR產物和pEGFPC2質粒，回收純化酶切產物，并利用T4 DNA Ligase將其連接。轉化，挑選克隆進行序列測定。

1.2.3 細胞培養和轉染 人膠質瘤細胞系SF767采用DMEM培養基，10%胎牛血清常規培養。表達ZNF185和空載體綠色熒光蛋白質粒轉染采用Lipofactamine 2000，按操作說明進行。為獲得穩定轉染ZNF185的細胞，SF767細胞在轉染24 h后，1∶2分離培養過夜，加入G418（600 mg/mL）篩選抗性克隆。選擇培養1個月后，采用流式細胞儀分選陽性細胞，分別命名為EGFPC2-ZNF185和EGFPC2，常規培養。

1.2.4 免疫熒光染色 在涂布纖維黏連蛋白（10 mg/mL）的玻片上培養EGFPC2-ZNF185和EGFPC2轉染的SF767細胞，PBS沖洗，4%多聚甲醛中固定20 min，然后用0.1%的Triton X-100/PBS透膜5 min。采用Hoechst進行細胞核染色，Phalloidin-TRITC（1∶40）標記肌動蛋白纖維。熒光顯微鏡觀察ZNF185在細胞內的定位和與肌動蛋白纖維的結合。

1.2.5 細胞劃線法檢測細胞遷移 分別將EGFPC2-ZNF185和EGFPC2空載體穩定轉染的SF767細胞接種24孔板，2×105個細胞/孔。在孔內細胞匯合度＞90%時，用滅菌200 μL加樣器槍頭在垂直于孔背面的橫線處劃痕標記，采用熒光顯微鏡和Image J 1.48u軟件觀察和測量劃痕寬度，每1個視野測量3處不同位點。48 h后，采用同樣方法測量細胞劃痕寬度，根據2次劃痕寬度的差值判斷細胞遷移能力。遷移率=（0 h劃線寬度-48 h劃線寬度）/0 h劃線寬度×100%。

1.2.6 Transwell小室檢測細胞遷移 實驗分為EGFPC2-ZNF185和EGFPC2空載體轉染組。消化每組SF767細胞，無血清培養基洗滌3次，調整細胞濃度為2×106/mL。分別取每組細胞懸液100 μL加入Transwell上室，下室加500 μL完全培養基，每組細胞設3個復孔，37℃、5%CO2孵育24 h，棄培養基，棉簽輕擦拭上室細胞。取出Transwell用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定10 min，倒置，風干，用0.1%結晶紫染色25 min，PBS洗滌3次，再用棉簽輕擦凈上室細胞，倒置顯微鏡下每個樣本隨機計數5個視野的細胞數，取均數作為遷移細胞數，實驗重復3次。遷移抑制率=（EGFPC2轉染組穿膜細胞數-EGFPC2-ZNF185轉染組穿膜細胞數）/EGFPC2轉染組穿膜細胞數×100%。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 ZNF185在人腦膠質瘤細胞中表達水平變化

Western blot檢測瘤旁正常組織和人腦膠質瘤及膠質瘤細胞系SF767中ZNF185的表達，發現與瘤旁正常組織相比，ZNF185在人膠質瘤及膠質瘤細胞系SF767中的表達分別降低66.91%和63.24%（P＜0.05，圖1）。

2.2 ZNF185基因克隆

從手術切除的膠質瘤旁正常組織提取總RNA，反轉錄成cDNA后采用ZNF185基因特異引物擴增，擴增產物克隆至pEGFPC2載體，測序分析表明，克隆cDNA包含全長ZNF185編碼序列。此序列羧基端含有2個鋅指結構組成的LIM結構域，氨基端為肌動蛋白骨架結合結構域（ATD）（圖2）。

2.3 ZNF185蛋白的細胞定位分析

分別將編碼ZNF185蛋白的EGFPC2-ZNF185質粒和空載體EGFPC2質粒轉染人膠質瘤細胞SF767，同時采用Hoechst染細胞核，熒光顯微鏡觀察ZNF185的細胞定位。EGFPC2質粒表達綠色熒光蛋白，在細胞核和細胞質均分布；而EGFPC2-ZNF185質粒編碼的ZNF185-綠色熒光蛋白融合蛋白，主要分布于細胞質和細胞膜（圖3）；進一步采用Phalloidin-TRITC紅色熒光標記肌動蛋白纖維，發現空載體EGFPC2編碼的綠色熒光蛋白與肌動蛋白染色分離，而ZNF185-綠色熒光蛋白與肌動蛋白染色重疊，表明ZNF185在細胞內與肌動蛋白纖維結合（圖3）。

2.4 過表達ZNF185對SF767細胞遷移的影響

肌動蛋白纖維是重要的細胞骨架蛋白，參與細胞形態的維持和細胞的運動。ZNF185在SF767細胞中與肌動蛋白結合，提示ZNF185可能調控SF767細胞的遷移。為此，本研究分別將EGFPC2空載質粒和EGFPC2-ZNF185質粒轉染SF767細胞，經G418篩選后獲得穩定轉染細胞株。Western blot檢測顯示，轉染EGFPC2-ZNF185質粒細胞與轉染空載質粒細胞相比，ZNF185的表達顯著增加（圖4A）。采用細胞劃線法檢測過表達ZNF185對SF767細胞遷移的影響，發現在細胞劃線48 h后，轉染EGFPC2-ZNF185質粒SF767細胞的遷移率為47.88%，而轉染EGFPC2空載質粒細胞的遷移率為63.34%，二者相比降低15.46%，遷移抑制率達24.4%（P＜0.05，圖4B，4C）。近一步采用Transwell小室檢測過表達ZNF185對SF767細胞遷移的影響，發現轉染EGFPC2-ZNF185的SF767穿膜細胞數較轉染EGFPC2空載質粒SF767的穿膜細胞數顯著減少，遷移抑制率達31.37%（P＜0.05，圖4D，表1）。

圖1 Western blot檢測ZNF185的表達Figure 1 Western blot detection of ZNF185 expression

圖2 ZNF185表達質粒的構建Figure 2 Construction of ZNF185 expression plasmid from normal human brain tissues

圖3 熒光顯微鏡觀察ZNF185在SF767細胞中的定位及與肌動蛋白actin的結合Figure 3 Immunofluorescence detection of ZNF185 cellular location and its interaction with actin filaments in SF767 cells

圖4 過表達ZNF185對SF767細胞遷移的影響Table 4 Effects of ZNF185 overexpression on the migration of SF767 cells

表1 Transwell小室檢測過表達ZNF185對SF767細胞遷移的影響 （n=3±s）Table 1 Effect of ZNF185 overexpression on the migration of SF767 cells （n=3，±s）

表1 Transwell小室檢測過表達ZNF185對SF767細胞遷移的影響 （n=3±s）Table 1 Effect of ZNF185 overexpression on the migration of SF767 cells （n=3，±s）

Cell count 136.4±4.83 93.6±4.21* IR（%）—31.37±2.49* Groups EGFPC2 EGFPC2-ZNF185 IR：inhibitory rate；*P＜0.05，vs.EGFPC2

3 討論

人腦膠質瘤是神經系統常見的腫瘤，約占顱內原發腫瘤的40%～60%，惡性膠質瘤的預后相對較差。膠質母細胞瘤1年生存率約30%，而5年的生存率不足5%［6］。研究表明膠質瘤的發生和發展與多種癌基因的異常表達增加和（或）抑癌基因的表達降低有關［7］。然而對其發生、發展的分子機制仍缺乏全面了解。因此進一步尋找與膠質瘤發生、發展關系密切的新基因并深入探索其功能，對于設計合理的治療藥物及判斷預后，進一步提高膠質瘤的治療水平具有重要意義。

鋅指蛋白（ZNF）是一類含Zn2+離子并具有手指狀結構域的蛋白質，由于其自身的結構特點，可以選擇性地結合特異的靶結構，使鋅指蛋白在基因的表達調控、細胞分化、胚胎發育等生命過程中發揮重要作用。ZNF185由于其羧基端含有2個鋅指結構組成的LIM結構域，又稱LIM結構域蛋白，ZNF185在人類多種組織表達，前列腺組織表達最高，骨髓、外周血、腦、肺、腎等組織也有較高表達。有趣的是在相應的腫瘤如前列腺癌、白血病、肺癌等組織中，ZNF185的表達顯著降低，并且與癌癥的嚴重程度和轉移程度呈正比［3-5，8］。

目前尚不明確ZNF185是否在人膠質瘤的發生和發展過程中發揮作用。本研究發現，與瘤旁正常腦組織相比，ZNF185在人腦膠質瘤組織和細胞系中表達降低，表明ZNF185發揮較普遍的抑癌基因功能。大量LIM結構域蛋白不僅具有調控細胞增殖和分化功能，也可通過與細胞骨架蛋白或細胞外基質成分相互作用，調節細胞的變形、運動、黏附及信號轉導功能［9］。通過ZNF85表達質粒的構建及測序，發現ZNF185蛋白氨基端有一個肌動蛋白結合結構域（ATD），而免疫熒光染色結果進一步證實ZNF185可與細胞肌動蛋白纖維結合。由于膠質瘤是一種具有高局部侵襲性和增殖性的腫瘤，同時細胞肌動蛋白纖維骨架系統在維持細胞形態以及腫瘤細胞遷移、侵襲過程中發揮作用。為此，本研究采用細胞劃線和Transwell小室兩種方法檢測ZNF185對膠質瘤細胞遷移的影響，盡管結果存在一定差異，但二者均顯示過表達ZNF185對SF767細胞的遷移具有顯著抑制作用。

LIM蛋白參與調控腫瘤細胞的遷移和侵襲。Xu等［10］報道上調FHL1（four and a half LIM domains 1）的表達可顯著抑制胃癌MKN45細胞的遷移和侵襲。Liu等［11］發現LHX6（LIM homeobox domain 6）在肺癌組織中表達降低，而過表達LHX6則顯著抑制肺癌95D和H358細胞的存活和遷移。一些在腫瘤細胞中表達增加的LIM蛋白如LIMD2、LIMK1促進腫瘤細胞的遷移和侵襲［12-13］。可見，LIM蛋白對腫瘤細胞遷移和侵襲的影響與其抑癌或癌基因功能的發揮密切相關。ZNF185在人腦膠質瘤細胞中具有抑癌基因功能，這與其發揮抑制腫瘤細胞遷移的作用一致。另外，研究顯示多種蛋白如Pten、Plex-B3以及RhoGTP酶系統可通過調節肌動蛋白纖維的聚合或定位影響膠質瘤細胞的遷移［14-16］。對于ZNF185如何通過細胞肌動蛋白纖維抑制人腦膠質瘤細胞的遷移，其分子機制和信號途徑目前仍不清楚，有待在今后實驗中逐步解決。

總之，本研究提示鋅指蛋白ZNF185在人腦膠質瘤細胞中發揮抑癌基因的作用，過表達ZNF185可顯著抑制膠質瘤細胞的遷移，其抑制機制可能與ZNF185與肌動蛋白纖維的相互作用有關。研究結果為尋找針對人腦膠質瘤新的治療靶點提供了線索。

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（2014-04-18收稿）

（2014-07-08修回）

（本文編輯：邢穎）

Effect of Zinc finger protein 185 on the migration of human glioma cells

Bin LU1,Quanhui ZHENG2

Quanhui ZHENG;E-mail:zhqhdlp@sohu.com
1Department of Neurosurgery,Tangshan Worker's Hospital,Tangshan 063000;2College of Basic Medicine,Hebei United University,Tangshan 063000,China.
This work was supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province(No.H2013209019)and the Foundation of Tangshan Science and Technology Bureau(No.13130290z).

Objective:To explore the effect of Zinc finger protein 185(ZNF185)on the migration of human gliocytoma cells.Methods:ZNF185 protein expression in human gliocytoma and its adjacent normal tissues was detected through Western blot.The ZNF185 gene was cloned and transfected into the human gliocytoma cell line SF767.ZNF185 cells were located through immunofluorescence staining,and cell migration was analyzed using the cell scoring method.Results:CZNF185 protein expression was lower in the human gliocytoma cell line than in normal para-neoplastic tissues.ZNF185 protein was mainly expressed in the cytoplasm and cell membrane of the human gliocytoma cells and was co-located with F-actin.ZNF185 overexpression repressed the migration of human gliocytoma cells.Conclusion:ZNF185 represses the migration of human gliocytoma cells by binding to F-actin.

zinc finger protein,glioma,cell migration

10.3969/j.issn.1000-8179.20140592

①河北省唐山市工人醫院（河北省唐山市063000）；②河北聯合大學基礎醫學院

*本文課題受河北省自然科學基金（編號：H2013209019）和唐山市科技計劃項目（編號：13130290z）資助

鄭全輝 zhqhdlp@sohu.com

陸斌 碩士，副主任醫師。專業方向為神經外科治療。

E-mail：lubin1974@yahoo.com