紡織用中性蛋白酶MYS11菌株發酵條件的優化

趙文娟，徐升運（等）

摘要：研究了一株產紡織用中性蛋白酶MYS11菌株的培養基組成。結果表明，該菌株的發酵最適條件為碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。通過正交試驗優化了發酵條件，即培養基起始pH 6.8、接種量6%、發酵時間54 h、發酵溫度36 ℃。在最適條件下，MYS11菌株產酶活力達到1 884 U/mL，明顯高于優化前水平。

關鍵詞：紡織；中性蛋白酶；菌株；發酵條件

中圖分類號：Q814.1；TS136 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1641-04

Optimizing the Fermentation Conditions of the MYS11 Strain Producing Neutral Protease for the Textiles

ZHAO Wen-juan1，XU Sheng-yun1，MA Qi2，REN Ping2，QIN Tao1

（1.Institute of Enzyme Engineering，Shaanxi Academy of Sciences， Xian 710600，China；

2.Shaanxi Engineering Center for Enzyme Technology， Xian 710600，China）

Abstract： The fermentation medium of a MYS11 strain producing neutral protease for the textiles were studied. The results showed that the optimal medium was consisted of the carbon source 3% corn powder， the nitrogen source 1% soyabean protein powder， and 0.2% KH2PO4. The fermentation conditions were optimized by the orthogonal experiment. The optimum culture were initial pH 6.8， inoculation volume 6%， the time 54 h and the temperature 36 ℃. Under the optimal conditions， the activity of neutral protease from MYS11 reached 1 884 U/mL， increased obviously than before the optimization.

Key words： textiles； neutral protease； strain； fermentation condition

中性蛋白酶是應用于工業化生產的蛋白酶制劑之一，廣泛應用于食品、飼料、紡織、洗滌、皮革脫毛軟化、畜禽血液蛋白質水解、果酒啤酒和飲料的澄清以及醫學治療等應用領域中[1-5]。在紡織行業中應用中性蛋白酶進行紡織品整理以及毛織物防氈縮處理，具有廣泛的應用前景，已成為研究的熱點[6，7]。但是中性蛋白酶的發酵單位一直很低，使用成本高，導致該蛋白酶在紡織上應用受到較大的影響，如何提高中性蛋白酶的發酵單位，成為酶制劑發酵中的難題，其中培養基的組成及發酵條件對中性蛋白酶的產生起著決定性的作用。因此，本研究對產紡織用中性蛋白酶的菌株MYS11的培養基及發酵條件進行優化研究，分析產酶變化，以提高菌株產酶能力。

1 材料與方法

1.1 菌種

MYS11是陜西省科學院酶工程研究所從土壤中分離得到的產紡織用中性蛋白酶菌株。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：L-Tyrosine（酪氨酸）（Sigma公司）；干酪素（酪蛋白）（上海潤捷化學試劑有限公司）；其他藥品均為國產分析純，水為去離子水。

儀器：UV-640型紫外分光光度計、恒溫調速搖瓶柜、高速冷凍離心機、水浴鍋等。

1.3 培養基

種子培養基（質量分數）：牛肉膏0.5%，蛋白胨0.6%，NaCl 0.5%，pH 7.0。

基礎發酵培養基（質量分數）：可溶性淀粉3%，蛋白胨1%，KH2PO4 0.1%，K2HPO4 0.1%，MgCl2 0.1%，pH 7.0。

1.4 酪氨酸標準曲線的制作

分別測定濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL酪氨酸在波長680 nm處的吸光度，根據吸光度值繪制標準曲線[8]。

1.5 中性蛋白酶活力測定

粗酶液的制備：在35 ℃條件下，接種量為5%（V/V），發酵48 h，取發酵液用4層紗布過濾制備粗酶液，用于測定中性蛋白酶的活力。

發酵液酶活力的測定參考文獻[8]。1 g固體酶粉（或1 mL液體酶）在一定溫度和pH下，1 min 水解酪蛋白產生1 ？滋g酪氨酸，即為一個酶活力單位，以U/mL（U/g）表示。

X=A×k×4/10×n

式中X為樣品酶活力，U/mL（U/g）；A為平均吸光度；k為吸光常數；4為反應試劑的總體積（mL）；10為反應時間10 min，以1 min計；n為稀釋倍數。

1.6 發酵培養基的選擇

對培養基中的碳源、氮源和無機鹽進行試驗，根據產酶活力的變化確定發酵培養基的組成。①碳源：將基礎發酵培養基中的3%可溶性淀粉（對照），分別用相同含量的葡萄糖、果糖、麥芽糖、玉米淀粉、乳糖、玉米粉和麩皮進行替換，其他成分和含量不變，按“1.5”的方法進行發酵培養，測定發酵液中性蛋白酶的活力，以初始發酵培養基的酶活力作為對照，確定最佳碳源；②氮源：以3%玉米粉為碳源，將初始發酵培養基中的1%蛋白胨（對照），分別用相同含量的大豆蛋白粉、牛肉膏、酵母膏、尿素、硝酸銨和豆餅粉替換，其他操作同上，確定最佳氮源；③無機鹽：確定發酵培養基的最適碳源、氮源，再將初始培養基中0.1%KH2PO4+0.1%K2HPO4（對照）的無機鹽替換為總量是0.2%的KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4、KCl、ZnCl2、FeCl2，其他操作同上，選擇適宜的無機鹽。

1.7 單因素試驗

研究培養基起始pH、接種量、發酵時間、培養溫度對菌株產中性蛋白酶酶活力的影響。①培養基起始pH。用0.2 mol/L NaOH或HCl將發酵培養基的起始pH分別調為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在“1.6”篩選的培養基上進行發酵培養，測定中性蛋白酶酶活力；②接種量。在篩選培養基起始pH的基礎上，將種子培養液按 4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%分別進行接種發酵，測定中性蛋白酶酶活力；③發酵時間。在培養基起始pH、接種量篩選的基礎上，以12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h不同時間段進行發酵，測定中性蛋白酶酶活力；④發酵溫度。在前期試驗的基礎上，在28、30、32、34、36、38、40 ℃的溫度下，進行發酵試驗，測定中性蛋白酶酶活力。

1.8 發酵條件的優化

以上述單因素試驗為基礎，以培養基起始pH、發酵時間、發酵溫度為因子，進行3因素3水平正交L9（33）試驗，每個處理3次重復，優化發酵條件。正交試驗因素和水平見表1。

2 結果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線

繪制的酪氨酸標準曲線見圖1。通過圖1的線性相關性可以看出，標準曲線的線性關系良好，計算得到蛋白酶活力公式中的常數k=96.91，在標準要求的95～100之間，因此該標準曲線滿足應用的要求，是可行的。

2.2 發酵培養基的選擇

2.2.1 最適碳源的確定 從圖2可以看出，以玉米粉、果糖為發酵培養基的碳源時，中性蛋白酶酶活力都高于對照可溶性淀粉，以玉米粉為碳源時發酵液中性蛋白酶酶活力最高，達到1 380 U/mL，因此確定發酵培養基的最適碳源為玉米粉。

2.2.2 最適氮源的確定 由圖3 可以看出，以大豆蛋白粉、牛肉膏為發酵培養基的氮源時，發酵液中性蛋白酶酶活力都高于對照，其中以大豆蛋白粉為氮源時發酵液酶活力最高，達到1 460 U/mL。因此，確定發酵培養基最適氮源為大豆蛋白粉。

2.2.3 無機鹽對產酶的影響 由圖4可以看出，當培養基中添加不同的無機鹽，對產酶的影響不同，其中添加0.2%的KCl、ZnCl2、FeCl2不利于產酶，而添加0.2% KH2PO4對產酶最有利，因此選擇在發酵培養基中添加0.2% KH2PO4。

2.3 發酵條件的優化

2.3.1 培養基起始pH對產酶的影響 由圖5可知，當培養基起始pH在5.0～7.0之間時菌株產中性蛋白酶酶活力不斷增加；發酵培養基的起始pH大于7.0時，中性蛋白酶酶活力下降，因此培養基起始pH對產酶影響較大。當培養基起始pH在7.0左右時對產酶最為有利，所以確定培養基起始pH為7.0。

2.3.2 接種量對產酶的影響 由圖6可知，接種量的不同對菌株產中性蛋白酶也有一定的影響，當接種量在4%～6%時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而增大；當接種量大于6%時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而減小，因此確定接種量為6%。

2.3.3 發酵時間對產酶的影響 由圖7可知，在培養48 h時，菌株產中性蛋白酶酶活力達到峰值，當培養時間超過48 h時，中性蛋白酶酶活力隨時間的延長而變化不大。因此，確定發酵時間為48 h。

2.3.4 發酵溫度對產酶的影響 由圖8可知，當發酵溫度小于36 ℃時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而增加；當溫度大于36 ℃時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而降低。因此，確定發酵溫度為36 ℃。

2.3.5 發酵條件的優化 正交試驗優化發酵條件的結果見表2。由表2可知，對菌株產中性蛋白酶酶活力影響最大的是發酵時間，其次是培養基起始pH，最后是發酵溫度。綜合考慮，得出菌株產中性蛋白酶培養基最佳發酵條件為A3B2C1，即發酵時間為54 h、培養基起始pH 6.8、發酵溫度36 ℃，得到的發酵液產中性蛋白酶酶活力達1 884 U/mL。

3 小結

通過對產中性蛋白酶的MYS11菌株產酶培養基的碳源、氮源、無機鹽進行研究，確定發酵培養基的組成為碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。采用正交試驗優化后的發酵條件為培養基起始pH 6.8、接種量為6%、發酵時間為54 h、發酵溫度36 ℃。產中性蛋白酶的MYS11菌株在最適發酵條件及培養基組成下，其產酶活性達到1 884 U/mL，與優化前相比有明顯的提高，作為原始野生菌株通過誘變篩選，可進一步提高產酶能力，為工業化生產奠定基礎，具有良好的開發應用前景。

參考文獻：

[1] 李泰明，徐秀蘭，李 偉.AS1.398中性蛋白酶固定化條件的初步研究[J].藥物生物技術，1998，5（4）：214-218.

[2] 唐 兵，周林峰，陳向東，等.嗜熱脂肪芽胞桿菌高溫中性蛋白酶的產生條件及酶學性質[J].微生物學報，2000，40（2）：188-192.

[3] 李水泉，姚 恕.中性蛋白酶發酵工藝優化研究[J].微生物學通報，1995，22（3）：150-153.

[4] TAKII Y，URATA Y，UENO N.Themmostable neutral protease resembling thermolysin derived from Bacillus brevis MTB001[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，1998，62（5）：1028-1030.

[5] 肖懷秋，林親錄，李玉珍，等.中性蛋白酶芽孢桿菌BX-4產酶條件及部分酶學性質[J].食品與生物技術學報，2005，24（4）：42-46，56.

[6] 劉延波，姚金波，張耀明，等.用KMnO4/中性蛋白酶法對羊毛進行減量加工的研究[J].毛紡科技，1998（2）：33-37.

[7] 王利平，武志云，閆亦農.WS中性蛋白酶羊毛減量處理[J].毛紡科技，2009（5）：21-24.

[8] QB/T 1803—1993，工業酶制劑通用試驗方法[S].

1.7 單因素試驗

研究培養基起始pH、接種量、發酵時間、培養溫度對菌株產中性蛋白酶酶活力的影響。①培養基起始pH。用0.2 mol/L NaOH或HCl將發酵培養基的起始pH分別調為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在“1.6”篩選的培養基上進行發酵培養，測定中性蛋白酶酶活力；②接種量。在篩選培養基起始pH的基礎上，將種子培養液按 4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%分別進行接種發酵，測定中性蛋白酶酶活力；③發酵時間。在培養基起始pH、接種量篩選的基礎上，以12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h不同時間段進行發酵，測定中性蛋白酶酶活力；④發酵溫度。在前期試驗的基礎上，在28、30、32、34、36、38、40 ℃的溫度下，進行發酵試驗，測定中性蛋白酶酶活力。

1.8 發酵條件的優化

以上述單因素試驗為基礎，以培養基起始pH、發酵時間、發酵溫度為因子，進行3因素3水平正交L9（33）試驗，每個處理3次重復，優化發酵條件。正交試驗因素和水平見表1。

2 結果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線

繪制的酪氨酸標準曲線見圖1。通過圖1的線性相關性可以看出，標準曲線的線性關系良好，計算得到蛋白酶活力公式中的常數k=96.91，在標準要求的95～100之間，因此該標準曲線滿足應用的要求，是可行的。

2.2 發酵培養基的選擇

2.2.1 最適碳源的確定 從圖2可以看出，以玉米粉、果糖為發酵培養基的碳源時，中性蛋白酶酶活力都高于對照可溶性淀粉，以玉米粉為碳源時發酵液中性蛋白酶酶活力最高，達到1 380 U/mL，因此確定發酵培養基的最適碳源為玉米粉。

2.2.2 最適氮源的確定 由圖3 可以看出，以大豆蛋白粉、牛肉膏為發酵培養基的氮源時，發酵液中性蛋白酶酶活力都高于對照，其中以大豆蛋白粉為氮源時發酵液酶活力最高，達到1 460 U/mL。因此，確定發酵培養基最適氮源為大豆蛋白粉。

2.2.3 無機鹽對產酶的影響 由圖4可以看出，當培養基中添加不同的無機鹽，對產酶的影響不同，其中添加0.2%的KCl、ZnCl2、FeCl2不利于產酶，而添加0.2% KH2PO4對產酶最有利，因此選擇在發酵培養基中添加0.2% KH2PO4。

2.3 發酵條件的優化

2.3.1 培養基起始pH對產酶的影響 由圖5可知，當培養基起始pH在5.0～7.0之間時菌株產中性蛋白酶酶活力不斷增加；發酵培養基的起始pH大于7.0時，中性蛋白酶酶活力下降，因此培養基起始pH對產酶影響較大。當培養基起始pH在7.0左右時對產酶最為有利，所以確定培養基起始pH為7.0。

2.3.2 接種量對產酶的影響 由圖6可知，接種量的不同對菌株產中性蛋白酶也有一定的影響，當接種量在4%～6%時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而增大；當接種量大于6%時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而減小，因此確定接種量為6%。

2.3.3 發酵時間對產酶的影響 由圖7可知，在培養48 h時，菌株產中性蛋白酶酶活力達到峰值，當培養時間超過48 h時，中性蛋白酶酶活力隨時間的延長而變化不大。因此，確定發酵時間為48 h。

2.3.4 發酵溫度對產酶的影響 由圖8可知，當發酵溫度小于36 ℃時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而增加；當溫度大于36 ℃時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而降低。因此，確定發酵溫度為36 ℃。

2.3.5 發酵條件的優化 正交試驗優化發酵條件的結果見表2。由表2可知，對菌株產中性蛋白酶酶活力影響最大的是發酵時間，其次是培養基起始pH，最后是發酵溫度。綜合考慮，得出菌株產中性蛋白酶培養基最佳發酵條件為A3B2C1，即發酵時間為54 h、培養基起始pH 6.8、發酵溫度36 ℃，得到的發酵液產中性蛋白酶酶活力達1 884 U/mL。

3 小結

通過對產中性蛋白酶的MYS11菌株產酶培養基的碳源、氮源、無機鹽進行研究，確定發酵培養基的組成為碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。采用正交試驗優化后的發酵條件為培養基起始pH 6.8、接種量為6%、發酵時間為54 h、發酵溫度36 ℃。產中性蛋白酶的MYS11菌株在最適發酵條件及培養基組成下，其產酶活性達到1 884 U/mL，與優化前相比有明顯的提高，作為原始野生菌株通過誘變篩選，可進一步提高產酶能力，為工業化生產奠定基礎，具有良好的開發應用前景。

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1.7 單因素試驗

研究培養基起始pH、接種量、發酵時間、培養溫度對菌株產中性蛋白酶酶活力的影響。①培養基起始pH。用0.2 mol/L NaOH或HCl將發酵培養基的起始pH分別調為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在“1.6”篩選的培養基上進行發酵培養，測定中性蛋白酶酶活力；②接種量。在篩選培養基起始pH的基礎上，將種子培養液按 4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%分別進行接種發酵，測定中性蛋白酶酶活力；③發酵時間。在培養基起始pH、接種量篩選的基礎上，以12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h不同時間段進行發酵，測定中性蛋白酶酶活力；④發酵溫度。在前期試驗的基礎上，在28、30、32、34、36、38、40 ℃的溫度下，進行發酵試驗，測定中性蛋白酶酶活力。

1.8 發酵條件的優化

以上述單因素試驗為基礎，以培養基起始pH、發酵時間、發酵溫度為因子，進行3因素3水平正交L9（33）試驗，每個處理3次重復，優化發酵條件。正交試驗因素和水平見表1。

2 結果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線

繪制的酪氨酸標準曲線見圖1。通過圖1的線性相關性可以看出，標準曲線的線性關系良好，計算得到蛋白酶活力公式中的常數k=96.91，在標準要求的95～100之間，因此該標準曲線滿足應用的要求，是可行的。

2.2 發酵培養基的選擇

2.2.1 最適碳源的確定 從圖2可以看出，以玉米粉、果糖為發酵培養基的碳源時，中性蛋白酶酶活力都高于對照可溶性淀粉，以玉米粉為碳源時發酵液中性蛋白酶酶活力最高，達到1 380 U/mL，因此確定發酵培養基的最適碳源為玉米粉。

2.2.2 最適氮源的確定 由圖3 可以看出，以大豆蛋白粉、牛肉膏為發酵培養基的氮源時，發酵液中性蛋白酶酶活力都高于對照，其中以大豆蛋白粉為氮源時發酵液酶活力最高，達到1 460 U/mL。因此，確定發酵培養基最適氮源為大豆蛋白粉。

2.2.3 無機鹽對產酶的影響 由圖4可以看出，當培養基中添加不同的無機鹽，對產酶的影響不同，其中添加0.2%的KCl、ZnCl2、FeCl2不利于產酶，而添加0.2% KH2PO4對產酶最有利，因此選擇在發酵培養基中添加0.2% KH2PO4。

2.3 發酵條件的優化

2.3.1 培養基起始pH對產酶的影響 由圖5可知，當培養基起始pH在5.0～7.0之間時菌株產中性蛋白酶酶活力不斷增加；發酵培養基的起始pH大于7.0時，中性蛋白酶酶活力下降，因此培養基起始pH對產酶影響較大。當培養基起始pH在7.0左右時對產酶最為有利，所以確定培養基起始pH為7.0。

2.3.2 接種量對產酶的影響 由圖6可知，接種量的不同對菌株產中性蛋白酶也有一定的影響，當接種量在4%～6%時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而增大；當接種量大于6%時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而減小，因此確定接種量為6%。

2.3.3 發酵時間對產酶的影響 由圖7可知，在培養48 h時，菌株產中性蛋白酶酶活力達到峰值，當培養時間超過48 h時，中性蛋白酶酶活力隨時間的延長而變化不大。因此，確定發酵時間為48 h。

2.3.4 發酵溫度對產酶的影響 由圖8可知，當發酵溫度小于36 ℃時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而增加；當溫度大于36 ℃時，菌株產中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而降低。因此，確定發酵溫度為36 ℃。

2.3.5 發酵條件的優化 正交試驗優化發酵條件的結果見表2。由表2可知，對菌株產中性蛋白酶酶活力影響最大的是發酵時間，其次是培養基起始pH，最后是發酵溫度。綜合考慮，得出菌株產中性蛋白酶培養基最佳發酵條件為A3B2C1，即發酵時間為54 h、培養基起始pH 6.8、發酵溫度36 ℃，得到的發酵液產中性蛋白酶酶活力達1 884 U/mL。

3 小結

通過對產中性蛋白酶的MYS11菌株產酶培養基的碳源、氮源、無機鹽進行研究，確定發酵培養基的組成為碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。采用正交試驗優化后的發酵條件為培養基起始pH 6.8、接種量為6%、發酵時間為54 h、發酵溫度36 ℃。產中性蛋白酶的MYS11菌株在最適發酵條件及培養基組成下，其產酶活性達到1 884 U/mL，與優化前相比有明顯的提高，作為原始野生菌株通過誘變篩選，可進一步提高產酶能力，為工業化生產奠定基礎，具有良好的開發應用前景。

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[6] 劉延波，姚金波，張耀明，等.用KMnO4/中性蛋白酶法對羊毛進行減量加工的研究[J].毛紡科技，1998（2）：33-37.

[7] 王利平，武志云，閆亦農.WS中性蛋白酶羊毛減量處理[J].毛紡科技，2009（5）：21-24.

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