HPLC法對唐古特瑞香中瑞香素和芫花素含量的測定

文慧，盧永昌

摘要：建立同時測定唐古特瑞香（Daphne tangutica）中瑞香素和芫花素的含量的HPLC方法。采用Agilent ZORBAX（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；檢測波長為360 nm；柱溫為30 ℃。結果表明，瑞香素在0.115～0.920 μg內線性關系良好（R2=0.999 9），其平均回收率為99.19%，RSD=1.2%（n=9）。芫花素在0.011～0.088 μg內線性關系良好（R2=0.999 9），其平均回收率為100.25%，RSD=1.5%（n=9）。該方法樣品處理簡單、準確度高、分離效果好，適用于該藥的成分測定。

關鍵詞： 高效液相色譜；瑞香素；芫花素；唐古特瑞香（Daphne tangutica）

中圖分類號：O657.32 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1654-03

Determination of Daphnetin and Genkwanin in Daphne tangutica by HPLC Method

WEN Hui， LU Yong-chang

（College of Life Science and Chemistry， Qinghai University for Nationalities， Xining 810007， Qinghai， China）

Abstract： The high performance liquid chromatography（HPLC） was used to simultaneously determine daphnetin and genkwanin in Daphne tangutica. The samples were separated on Agilent ZORBAX（4.6 mm×250 mm，5 μm） column. Detection wavelength was 360 nm and column temperature was 30 ℃. The results showed that the linear range of daphnetin was good in 0.115～0.920 μg（R2=0.999 9） with the average recovery of 99.19% and RSD of 1.2%（n=9）. The linear range of genkwanin was good in 0.011～0.088 μg（R2=0.999 9） with the average recovery of 100.25% and RSD of 1.5%（n=9）. This method was simple， accurate，and suitable for determining components and quantities of daphnetin and genkwanin in Daphne tangutica.

Key words： HPLC； daphnetin； genkwanin； Daphne tangutica

唐古特瑞香（Daphne tangutica）為瑞香科植物的干燥根及莖[1]，主要分布在青海果洛、玉樹、黃南、海北等藏族自治州，生長在海拔2 700～3 100 m的林緣及灌叢中[2]，系傳統藏藥省相那瑪。常用于治療風濕痹痛、跌打損傷、風濕及類風濕性關節炎等疾病[3]。其主要化學成分為棕櫚酸、月桂酸、 β-谷甾醇、7-甲氧基-8-羥基香豆素、瑞香素、芫花素、羥基芫花素、對羥基苯甲酸等[4，5]。

對于唐古特瑞香中含量分析僅見瑞香素的報道[5]，芫花素尚未見報道，本研究采用HPLC梯度洗脫法同時檢測唐古特瑞香中的瑞香素和芫花素的含量。試驗結果證明，該方法可操作性強、檢測靈敏度高、結果準確可靠、重現性好，能有效地控制藥品質量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（配備自動進樣器、在線脫氣機、四元梯度泵、柱溫箱、DAD檢測器、Agilent 1200色譜工作站）；KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；瑞香素對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-12071104，純度≥98%），芫花素對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-12073001，純度≥98%），甲醇為色譜純試劑，其他試劑均為分析純，水為去離子水。

1.2 色譜條件[6-8]

Agilent ZORBAX柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇（A）-0.04%磷酸水溶液（B）進行梯度洗脫：0～10 min，A∶B（39∶61，V/V）；10～15 min，調節流動相A∶B（40∶60，V/V）；15～18 min，調節流動相A∶B （69∶31，V/V）；18～23 min，調節流動相A∶B （72∶28，V/V）；23～40 min，調節流動相A∶B （90∶10，V/V）；檢測波長為360 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min。

1.3 對照品溶液的制備

精密稱取瑞香素對照品適量，加甲醇制成0.460 mg/mL的溶液，作為對照品儲備液；精密稱取芫花素對照品適量，加甲醇制成0.440 mg/mL的溶液，作為對照品儲備液；再精密量取瑞香素、芫花素對照品儲備液，加甲醇稀釋至刻度得混合后瑞香素、芫花素的濃度分別為0.022、0.023 mg/mL。

1.4 供試品溶液的制備[9]

1.4.1 提取溶劑的選擇[10] 取本品粗粉約0.5 g，2份，加入錐形瓶中，分別準確加入70%乙醇（V/V，下同）25 mL、70%甲醇（V/V）25 mL，分別稱定重量，超聲處理40 min，靜置至室溫，再稱定重量，補足損失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密吸取上述兩種供試品溶液各3 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為指標。結果表明，用兩種溶劑提取時，瑞香素的峰面積接近，但是芫花素的峰面積相差較大，所以以芫花素的峰面積為指標比較不同溶劑的提取效果。結果表明，乙醇的提取效果較好。故選用乙醇為提取溶劑。

1.4.2 提取溶劑濃度的選擇 取本品粗粉約0.5 g，2份，加入錐形瓶中，分別準確加入95%乙醇25 mL、70%乙醇25 mL、50%乙醇25 mL，分別稱定重量，超聲處理40 min，靜置至室溫，再稱定重量，補足損失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密吸取上述供試品溶液各3 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為指標。結果表明，瑞香素和芫花素峰面積表明用70%濃度的乙醇溶液提取效果最好。故選用70%乙醇為提取溶劑。

1.4.3 提取方法的選擇 取本品粗粉約0.5 g，2份，加入錐形瓶中，分別準確加入70%乙醇25 mL，稱定重量，分別超聲處理40 min，加熱回流，靜置至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補足損失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密吸取供試品溶液各3 μL，注入液相色譜儀，以峰面積為指標。結果表明，用加熱超聲方法提取效果最好。故選用加熱超聲為提取方法。

1.4.4 提取時間的選擇 取本品粗粉約0.5 g，3份，加入錐形瓶中，分別精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱超聲40、30、20 min，靜置至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補足損失的重量，搖勻，濾過，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密吸取供試品溶液3 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，以芫花素和瑞香素峰面積為指標，超聲40 min時，兩者含量最高。故選擇40 min為提取時間。

1.4.5 供試品溶液的制備 取本品粗粉約0.5 g，加入錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱超聲40 min，等至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補足損失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，待測。見圖1。

2 結果與分析

2.1 線性范圍的考察

分別精密吸取瑞香素對照品溶液（0.046 mg/mL）和芫花素對照品溶液（0.044 mg/mL）各2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，按上述色譜條件進樣測定。分別以瑞香素與芫花素的峰面積為縱坐標，相對應的進樣量為橫坐標，進行線性擬合。瑞香素的回歸方程y=3 262.4x+7.221 7，（R2=0.999 9）；芫花素的回歸方程為y=3 904.2x+2.621 7，（R2=0.999 9）。表明瑞香素在0.115～0.920 μg，芫花素在0.011～0.088 μg內線性關系良好。見圖1。

2.2 精密度

取瑞香素和芫花素的混合對照品，連續進樣6次，每次進樣10 μL，瑞香素峰面積的RSD為1.10%，芫花素峰面積的RSD為0.97%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性

精密吸取供試液溶液10 μL，分別在0、2、4、6、12、16 h重復進樣6次，測定瑞香素和芫花素峰面積，結果表明，供試品溶液在16 h內穩定，瑞香素和芫花素峰面積RSD分別為1.25%、1.20%。

2.4 重復性

取同一批唐古特瑞香樣品，均勻混合后精密稱取6份，每份約0.5 g，按上述方法制備，分別進樣10 μL，記錄峰面積，并計算含量。瑞香素的平均含量為0.360%，RSD為0.76%，芫花素的平均含量為0.025%，RSD為1.00%，表明方法重現性好。

2.5 加樣回收試驗

取已知瑞香素和芫花素含量的唐古特瑞香樣品9份，每份約0.25 g，精密稱定，分別在上述9份藥材中加入瑞香素的對照品溶液和芫花素對照品溶液，按以上方法進行處理，制得供試品溶液，分別進樣10 μL，記錄瑞香素和芫花素的峰面積，計算含量，并計算回收率，結果見表1。瑞香素和芫花素的回收率平均值分別為99.19%、100.25%、RSD分別為1.20%、1.50%，表明加樣回收率好。

2.6 樣品測定

取各供試品0.5 g，按“1.4.5”項的方法制得樣品溶液，以上述色譜條件對5個批次的樣品進行瑞香素和芫花素含量測定，結果見表2。瑞香素和芫花素的含量平均值分別為0.340%、0.027%。

3 小結與討論

唐古特瑞香主要分布在青海果洛、玉樹、黃南、海北等藏族自治州。生長在海拔2 700～3 100 m的林緣及灌叢中[2]，系傳統藏藥省相那瑪。具有祛風除濕，止痛散瘀等功效，治風濕痹痛、關節炎、類風濕關節痛[3]。

比較了甲醇和乙醇不同溶劑的提取效率，乙醇的提取效果較好。也比較了不同濃度下的乙醇提取，70%的乙醇提取方法較好。同時運用超聲和回流兩種方式進行提取，用加熱超聲提取效果較好，所以選取超聲提取法。瑞香素在唐古特瑞香中含量較高，芫花素含量較低。采用HPLC梯度洗脫法同時測定瑞香素和芫花素的含量，方法簡便，重現性好，快速分離，有助于藥材質量控制更加完善。文獻中鮮見唐古特瑞香中芫花素的含量的測定的報道。本研究結果表明，該植物中總瑞香素和芫花素的含量平均值分別為0.340%、0.027%。

參考文獻：

[1] 青海省藥品檢驗所，青海省藏醫藥研究所.中國藏藥（第一卷）[M].上海.上海科技出版社，1996：545-546.

[2] 中國科學院西北高原生物研究所.青海經濟植物志[M].西寧.青海人民出版社，1987：392.

[3] 張 薇，蘇 娟，扈曉佳，等.中藥祖師麻的三種基源植物的化學及藥理活性[J].中國醫藥工業雜志，2007，38（3）：233.

[4] 袁小紅，徐春霞，周 敏，等.唐古特瑞香化學成分的研究[J].天然產物研究與開發，2007（19）：55-58.

[5] 劉榮華，梅崇燁，邵 峰，等.唐古特瑞香化學成分研究[J].中藥材，2009，32（12）：1846-1847.

[6] 劉亞蓉.唐古特瑞香中祖師麻甲素的HPLC法含量測定[J].山西中醫，2009，30（1）：85-87.

[7] 王紅剛.HPLC法測定沉香葉中芫花素含量[J].中醫藥導報，2008，14（3）：70.

[8] 張保獻，原思通，夏 沖.HPLC法測定芫花中芫花素的含量[J].中國中藥雜志，1996，21（4）：237-253.

[9] 楊秀娟，洪燕龍，吳 飛，等.HPLC測定鉤藤中鉤藤堿和異鉤藤堿的方法學探討[J].中國中藥雜志，2013，38（5）：720-724.

[10] 董嘉德.超聲技術在中藥提取中的應用[J].中國藥業.2002， 11（11）：55.

1.4.2 提取溶劑濃度的選擇 取本品粗粉約0.5 g，2份，加入錐形瓶中，分別準確加入95%乙醇25 mL、70%乙醇25 mL、50%乙醇25 mL，分別稱定重量，超聲處理40 min，靜置至室溫，再稱定重量，補足損失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密吸取上述供試品溶液各3 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為指標。結果表明，瑞香素和芫花素峰面積表明用70%濃度的乙醇溶液提取效果最好。故選用70%乙醇為提取溶劑。

1.4.3 提取方法的選擇 取本品粗粉約0.5 g，2份，加入錐形瓶中，分別準確加入70%乙醇25 mL，稱定重量，分別超聲處理40 min，加熱回流，靜置至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補足損失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密吸取供試品溶液各3 μL，注入液相色譜儀，以峰面積為指標。結果表明，用加熱超聲方法提取效果最好。故選用加熱超聲為提取方法。

1.4.4 提取時間的選擇 取本品粗粉約0.5 g，3份，加入錐形瓶中，分別精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱超聲40、30、20 min，靜置至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補足損失的重量，搖勻，濾過，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密吸取供試品溶液3 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，以芫花素和瑞香素峰面積為指標，超聲40 min時，兩者含量最高。故選擇40 min為提取時間。

1.4.5 供試品溶液的制備 取本品粗粉約0.5 g，加入錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱超聲40 min，等至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補足損失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，待測。見圖1。

2 結果與分析

2.1 線性范圍的考察

分別精密吸取瑞香素對照品溶液（0.046 mg/mL）和芫花素對照品溶液（0.044 mg/mL）各2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，按上述色譜條件進樣測定。分別以瑞香素與芫花素的峰面積為縱坐標，相對應的進樣量為橫坐標，進行線性擬合。瑞香素的回歸方程y=3 262.4x+7.221 7，（R2=0.999 9）；芫花素的回歸方程為y=3 904.2x+2.621 7，（R2=0.999 9）。表明瑞香素在0.115～0.920 μg，芫花素在0.011～0.088 μg內線性關系良好。見圖1。

2.2 精密度

取瑞香素和芫花素的混合對照品，連續進樣6次，每次進樣10 μL，瑞香素峰面積的RSD為1.10%，芫花素峰面積的RSD為0.97%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性

精密吸取供試液溶液10 μL，分別在0、2、4、6、12、16 h重復進樣6次，測定瑞香素和芫花素峰面積，結果表明，供試品溶液在16 h內穩定，瑞香素和芫花素峰面積RSD分別為1.25%、1.20%。

2.4 重復性

取同一批唐古特瑞香樣品，均勻混合后精密稱取6份，每份約0.5 g，按上述方法制備，分別進樣10 μL，記錄峰面積，并計算含量。瑞香素的平均含量為0.360%，RSD為0.76%，芫花素的平均含量為0.025%，RSD為1.00%，表明方法重現性好。

2.5 加樣回收試驗

取已知瑞香素和芫花素含量的唐古特瑞香樣品9份，每份約0.25 g，精密稱定，分別在上述9份藥材中加入瑞香素的對照品溶液和芫花素對照品溶液，按以上方法進行處理，制得供試品溶液，分別進樣10 μL，記錄瑞香素和芫花素的峰面積，計算含量，并計算回收率，結果見表1。瑞香素和芫花素的回收率平均值分別為99.19%、100.25%、RSD分別為1.20%、1.50%，表明加樣回收率好。

2.6 樣品測定

取各供試品0.5 g，按“1.4.5”項的方法制得樣品溶液，以上述色譜條件對5個批次的樣品進行瑞香素和芫花素含量測定，結果見表2。瑞香素和芫花素的含量平均值分別為0.340%、0.027%。

3 小結與討論

唐古特瑞香主要分布在青海果洛、玉樹、黃南、海北等藏族自治州。生長在海拔2 700～3 100 m的林緣及灌叢中[2]，系傳統藏藥省相那瑪。具有祛風除濕，止痛散瘀等功效，治風濕痹痛、關節炎、類風濕關節痛[3]。

比較了甲醇和乙醇不同溶劑的提取效率，乙醇的提取效果較好。也比較了不同濃度下的乙醇提取，70%的乙醇提取方法較好。同時運用超聲和回流兩種方式進行提取，用加熱超聲提取效果較好，所以選取超聲提取法。瑞香素在唐古特瑞香中含量較高，芫花素含量較低。采用HPLC梯度洗脫法同時測定瑞香素和芫花素的含量，方法簡便，重現性好，快速分離，有助于藥材質量控制更加完善。文獻中鮮見唐古特瑞香中芫花素的含量的測定的報道。本研究結果表明，該植物中總瑞香素和芫花素的含量平均值分別為0.340%、0.027%。

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[2] 中國科學院西北高原生物研究所.青海經濟植物志[M].西寧.青海人民出版社，1987：392.

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[7] 王紅剛.HPLC法測定沉香葉中芫花素含量[J].中醫藥導報，2008，14（3）：70.

[8] 張保獻，原思通，夏 沖.HPLC法測定芫花中芫花素的含量[J].中國中藥雜志，1996，21（4）：237-253.

[9] 楊秀娟，洪燕龍，吳 飛，等.HPLC測定鉤藤中鉤藤堿和異鉤藤堿的方法學探討[J].中國中藥雜志，2013，38（5）：720-724.

[10] 董嘉德.超聲技術在中藥提取中的應用[J].中國藥業.2002， 11（11）：55.

1.4.2 提取溶劑濃度的選擇 取本品粗粉約0.5 g，2份，加入錐形瓶中，分別準確加入95%乙醇25 mL、70%乙醇25 mL、50%乙醇25 mL，分別稱定重量，超聲處理40 min，靜置至室溫，再稱定重量，補足損失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密吸取上述供試品溶液各3 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為指標。結果表明，瑞香素和芫花素峰面積表明用70%濃度的乙醇溶液提取效果最好。故選用70%乙醇為提取溶劑。

1.4.3 提取方法的選擇 取本品粗粉約0.5 g，2份，加入錐形瓶中，分別準確加入70%乙醇25 mL，稱定重量，分別超聲處理40 min，加熱回流，靜置至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補足損失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密吸取供試品溶液各3 μL，注入液相色譜儀，以峰面積為指標。結果表明，用加熱超聲方法提取效果最好。故選用加熱超聲為提取方法。

1.4.4 提取時間的選擇 取本品粗粉約0.5 g，3份，加入錐形瓶中，分別精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱超聲40、30、20 min，靜置至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補足損失的重量，搖勻，濾過，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密吸取供試品溶液3 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，以芫花素和瑞香素峰面積為指標，超聲40 min時，兩者含量最高。故選擇40 min為提取時間。

1.4.5 供試品溶液的制備 取本品粗粉約0.5 g，加入錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱超聲40 min，等至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補足損失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，待測。見圖1。

2 結果與分析

2.1 線性范圍的考察

分別精密吸取瑞香素對照品溶液（0.046 mg/mL）和芫花素對照品溶液（0.044 mg/mL）各2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，按上述色譜條件進樣測定。分別以瑞香素與芫花素的峰面積為縱坐標，相對應的進樣量為橫坐標，進行線性擬合。瑞香素的回歸方程y=3 262.4x+7.221 7，（R2=0.999 9）；芫花素的回歸方程為y=3 904.2x+2.621 7，（R2=0.999 9）。表明瑞香素在0.115～0.920 μg，芫花素在0.011～0.088 μg內線性關系良好。見圖1。

2.2 精密度

取瑞香素和芫花素的混合對照品，連續進樣6次，每次進樣10 μL，瑞香素峰面積的RSD為1.10%，芫花素峰面積的RSD為0.97%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性

精密吸取供試液溶液10 μL，分別在0、2、4、6、12、16 h重復進樣6次，測定瑞香素和芫花素峰面積，結果表明，供試品溶液在16 h內穩定，瑞香素和芫花素峰面積RSD分別為1.25%、1.20%。

2.4 重復性

取同一批唐古特瑞香樣品，均勻混合后精密稱取6份，每份約0.5 g，按上述方法制備，分別進樣10 μL，記錄峰面積，并計算含量。瑞香素的平均含量為0.360%，RSD為0.76%，芫花素的平均含量為0.025%，RSD為1.00%，表明方法重現性好。

2.5 加樣回收試驗

取已知瑞香素和芫花素含量的唐古特瑞香樣品9份，每份約0.25 g，精密稱定，分別在上述9份藥材中加入瑞香素的對照品溶液和芫花素對照品溶液，按以上方法進行處理，制得供試品溶液，分別進樣10 μL，記錄瑞香素和芫花素的峰面積，計算含量，并計算回收率，結果見表1。瑞香素和芫花素的回收率平均值分別為99.19%、100.25%、RSD分別為1.20%、1.50%，表明加樣回收率好。

2.6 樣品測定

取各供試品0.5 g，按“1.4.5”項的方法制得樣品溶液，以上述色譜條件對5個批次的樣品進行瑞香素和芫花素含量測定，結果見表2。瑞香素和芫花素的含量平均值分別為0.340%、0.027%。

3 小結與討論

唐古特瑞香主要分布在青海果洛、玉樹、黃南、海北等藏族自治州。生長在海拔2 700～3 100 m的林緣及灌叢中[2]，系傳統藏藥省相那瑪。具有祛風除濕，止痛散瘀等功效，治風濕痹痛、關節炎、類風濕關節痛[3]。

比較了甲醇和乙醇不同溶劑的提取效率，乙醇的提取效果較好。也比較了不同濃度下的乙醇提取，70%的乙醇提取方法較好。同時運用超聲和回流兩種方式進行提取，用加熱超聲提取效果較好，所以選取超聲提取法。瑞香素在唐古特瑞香中含量較高，芫花素含量較低。采用HPLC梯度洗脫法同時測定瑞香素和芫花素的含量，方法簡便，重現性好，快速分離，有助于藥材質量控制更加完善。文獻中鮮見唐古特瑞香中芫花素的含量的測定的報道。本研究結果表明，該植物中總瑞香素和芫花素的含量平均值分別為0.340%、0.027%。

參考文獻：

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