薄層色譜和高效液相色譜用于矮地茶多糖的單糖組成分析

肖作奇+文曉柯+潘濤

[摘要] 目的 分析矮地茶多糖中的單糖組成及摩爾比值。 方法 采用硫酸水解多糖，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色譜法和薄層色譜法同時分析矮地茶多糖的單糖組成和摩爾比，Agilent TC-C18色譜柱，流動相：乙腈-pH為7.0的磷酸緩沖液（20∶80，0.1%），檢測波長：250 nm，流速：1 mL/min；柱溫：25℃。 結果 薄層色譜法和高效液相色譜法結果皆表明矮地茶多糖由葡萄糖（Glu）和半乳糖（Gal）組成，高效液相色譜法顯示矮地茶多糖中Glu和Gal的摩爾比值約為1∶2.36。 結論 薄層色譜法可用于矮地茶多糖的單糖組成的快速鑒別，方法快速、準確；高效液相色譜法可用于矮地茶多糖中單糖組成的鑒別和摩爾比值測量，方法簡單、靈敏、分離效率高。

[關鍵詞] 矮地茶；多糖；高效液相色譜；薄層色譜；單糖組成

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）10（c）-0130-04

[Abstract] Objective To analyze the monosaccharide composition and the molar ratio of Ardisia japonica Polysaccharide （AJP）. Methods Sulfuric acid was used to hydrolyze AJP. Pre-column 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazalone （PMP） derivation HPLC and TLC method were developed to determine the monosaccharide compositions and the molar ratio of AJP. The mobile phase was acetonitrile-pH 7.0 phosphate buffer （20∶80， 0.1%） with Agilent TC-C18 column. The detection wavelength was 250 nm， the flow rate was 1 mL/min， and the column temperature was 25 ℃. Results The results of TLC and HPLC analysis showed that AJP were consisted of glucose （Glu） and galactose （Gal）. Meanwhile， HPLC analysis showed that the molar ratio of AJP was 1∶2.36. Conclusion TLC which is fast and accurate， can be used for the rapid identification the monosaccharide composition in AJP. HPLC which is simple， sensitive and high separation efficiency， can be used for the quantitative analysis of the monosaccharide composition in AJP.

[Key words] Ardisia Japonica； Polysaccharide； HPLC； TLC； Monosaccharide Composition

矮地茶是紫金牛科植物Ardisia japonica（Thumb.） Blume的干燥全草，收錄于《中國藥典》2015年版[1]，具有止咳平喘、清利濕熱、活血化瘀的功效。現代研究證明，矮地茶水提取物具有良好的止咳、抗病毒、抗乙肝等生物活性[2-4]，其中主要化學成分除了內酯類（巖白菜素）、黃酮（槲皮素）等成分外[5-8]，還含有大量的多糖成分，多糖可能是矮地茶潛在的藥效成分之一。同時，越來越多的中外學者認為植物多糖是天然藥物中的主要藥效成分[9-10]。目前，關于矮地茶多糖的研究報道非常少，對多糖的單糖組成進行研究是多糖結構和生物活性深化研究的前提，基于此，筆者采用水提取、多次醇沉得到矮地茶多糖（AJP），用硫酸對AJP進行水解，參照相關文獻[11-20]，采用薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）兩種方法對矮地茶多糖中單糖組成和摩爾比進行分析，為矮地茶多糖的深入研究提供基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電子分析天平（Mettler Toledo XS205型，德國，d=0.01 mg），超聲清洗器（上海科導，HS-2060），色譜柱（安捷倫TC-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），薄層層析硅膠（硅膠G板，10 cm×20 cm，中國青島海洋化工集團公司），0.22 μm微孔濾膜（針式濾器，上海安譜科學儀器有限公司），高效液相色譜儀（日本島津，LC-20A型），柱溫箱（日本島津，CTO-10AS），二極管陣列檢測器（日本島津，SPD-M20A）。

1.2 藥品和試劑

水（娃哈哈純凈水），乙腈（Tedia，美國，色譜純）。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，P109105-100 g，批號：L1401046）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；葡萄糖（Glu，10010518，批號：20150630）、木糖（Xly，63012034，批號：20151010）、鼠李糖（Rha，63010234，批號：20150526）、果糖（Fru，63003034，批號：20150505）和半乳糖（Gal，63004434，批號：20141211）對照品購于國藥集團化學試劑有限公司。矮地茶藥材購自湖南省衡東縣中藥飲片廠（批號：20141026），藥材經湖南中醫藥大學附屬二醫院王竹鑫主任藥師鑒定為正品。其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 矮地茶多糖的制備

取矮地茶藥材粉末100 g，加入1.5 L水，90℃水浴提取1 h，過濾；濾渣再次加入1.5 L水，90℃水浴提取1 h，過濾，合并兩次濾液，濃縮至200 mL；加入無水乙醇使醇濃度達到80%，4℃靜置6 h，過濾，取濾渣；濾渣再次加入200 mL水溶解，加入無水乙醇使醇濃度達到80%，4℃靜置6 h，過濾，取濾渣，即得AJP。經苯酚-硫酸法測定，AJP糖純度為96.8%。

2.2 試劑配制

2 mol/L的硫酸溶液：取850 mL水加入1L容量瓶中，量取109 mL濃硫酸沿著容量瓶壁緩慢加入，放冷至室溫，加水定容，搖勻，即為2 mol/L的硫酸溶液。0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液：精密稱取8.00 g氫氧化鈉于1 L容量瓶中，加水定容，搖勻，即得。4 mol/L的氫氧化鈉溶液：精密稱取16.0 g氫氧化鈉于100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得。0.1 mol/L的鹽酸溶液：量取9.0 mL濃鹽酸于1 L容量瓶中，加水定容，搖勻，即得。0.5 mol/L的PMP溶液：精密稱取PMP 8.80 g于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

標準單糖溶液配制：分別稱取Gal（23.93 mg）、Rha（22.01 mg）、Fru（20.82 mg）、Xly（24.44 mg）和Glu（23.47 mg）于5 mL容量瓶中，加水定容，即得單糖標準品溶液。另取各種單糖于同一5 mL容量瓶中，加水定容，即得混合標準品溶液。

2.3 矮地茶多糖的水解

取矮地茶多糖約50 mg于具塞試管中，加入2 mL 2 mol/L的硫酸溶液80℃水浴水解2 h。水解完成后，加2 mL 4 mol/L的氫氧化鈉溶液，轉移至10 mL容量瓶，加少量水洗具塞試管兩次，洗液也轉移至同一容量瓶，加水定容，即為AJP水解液，備用。

2.4 TLC分析

取硅膠板105℃下活化30 min，取單糖標準品溶液和矮地茶多糖水解液點樣，點樣順序為Fru、Rha、Xly、Glu、Gal、AJP、AJP，點樣體積為5 μL。兩次展開，展開劑1∶正丁醇∶丙酮∶水體積比=4∶3∶1；展開劑2∶正丁醇∶乙酸乙酯∶異丙醇∶水體積比=8∶4∶7∶3。先用展開劑1展開至10 cm高度，取出晾干，再用展開劑2展開至10 cm高度，取出，晾干。顯色劑為2%二苯胺丙酮溶液∶2%苯胺丙酮溶液∶85%磷酸體積比=5∶5∶1。顯色條件為置105℃烘箱中加熱30 min。拍照記錄，結果見圖1。結果顯示，AJP水解產物與Glu和Gal在相同位置顯示相同顏色斑點，在其余位置無斑點，表明AJP由Glu和Gal組成。

2.5 單糖對照品和樣品衍生化

分別精密量取單糖標準品溶液（Fru、Rha、Xly、Glu、Gal）、混合標準品溶液和AJP水解液100 μL放入編號的7支具塞試管中，進行PMP衍生。步驟為：加入0.2 mol/L的NaOH水溶液500 μL，再加入0.5 mol/L的PMP溶液500 μL，混合均勻，在80℃水浴反應1 h，反應結束后取出試管與自來水中冷卻至室溫，再加入0.1 mol/L的HCl水溶液1000 μL中和反應液中的NaOH。用2 mL氯仿萃取三次，除去反應剩余的PMP，取水層溶液過0.22 μm微孔濾膜，即得衍生化樣品，供HPLC分析用。

2.6 色譜條件

色譜柱：C18，進樣量：10 μL，流動相：乙腈-pH為7.0的磷酸緩沖液（20∶80，0.1%），檢測波長：250 nm，流速：1 mL/min；柱溫：25℃，分析時間35 min。色譜圖見圖2。

2.7 線性關系考察

TLC結果表明，AJP中僅含有葡萄糖和半乳糖兩種單糖，所以該研究僅對葡萄糖和半乳糖的線性關系進行考察。分別取葡萄糖單糖標準液0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL于1 mL容量瓶中，加水定容至1 mL，按“2.5”項下條件衍生化，同法制備半乳糖不同濃度衍生化樣品。衍生化后進行HPLC分析，記錄峰面積，以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。葡萄糖和半乳糖線性方程分別為：Y=2697.63X-28.69（r2=0.999 8）和Y= 3057.15 X - 56.83 （r2=0.999 5），線性范圍分別為：0.045～2.235 μg和0.046～2.279 μg。

2.8 精密度試驗

取經過衍生化后的單糖對照品溶液，按“2.6”項下條件連續進行6次HPLC分析，記錄峰面積，葡萄糖和半乳糖的RSD分別為0.9%和1.0%，說明儀器精密度良好。

2.9 穩定性試驗

取AJP水解液PMP衍生化后的溶液，分別于放置0、2、4、6、12、24 h時后，按“2.6”項下色譜條件進行HPLC分析，記錄峰面積。統計結果顯示，葡萄糖和半乳糖RSD分別為1.5%和1.1%，證明AIP水解液衍生化后在24 h內穩定性好。

2.10 重復性試驗

精密稱取同一批次AJP樣品6份，每份約50 mg，按“2.3”項下條件水解，按“2.5”項下條件衍生化，按“2.6”項下色譜條件進行HPLC分析，記錄峰面積，計算樣品中葡萄糖和半乳糖含量。結果顯示葡萄糖和半乳糖含量RSD分別為1.7%、1.9%，表明方法重復性良好。

2.11 加樣回收試驗

精密稱取同一批次已知葡萄糖和半乳糖含量的AJP樣品6份，每份約25 mg，按表1中的量加入葡萄糖和半乳糖標準物質，按“2.3”項下條件水解，按“2.5”項下條件衍生化，按“2.6”項下色譜條件進行HPLC分析，記錄峰面積，計算加樣回收率，結果表明方法加樣回收率符合含量測定要求。見表1。

2.12 矮地茶多糖中單糖組成分析

分別按上述方法測定三批AJP樣品的單糖組成，計算結果表明AJP由葡萄糖和半乳糖組成，三批次摩爾比分別為1∶2.36、1∶2.32、1∶2.40，平均值為1∶2.36。

3 討論

筆者考察了三氟乙酸、鹽酸、硫酸等三種酸溶液對矮地茶多糖進行水解，發現三氟乙酸水解不完全，而鹽酸水解條件不易控制，所以選擇效果最佳的硫酸溶液，通過優化發現，2 mL 2 mol/L的硫酸溶液80℃水浴2 h能完全將矮地茶多糖水解，且不會出現碳化現象。同時，本研究對PMP衍生條件進行優化，發現溫度過高或過低都會導致衍生產物HPLC峰面積降低，80℃下衍生1 h以上能達到最大峰面積[21-33]。

通過TLC和HPLC兩種方法對矮地茶多糖中的單糖組成進行測定，結果顯示，矮地茶多糖由葡萄糖和半乳糖兩種單糖組成。TLC方法簡單快捷，可用于多糖中單糖組成的快速鑒別，操作簡單，對儀器依賴程度低，但其缺點是不能進行單糖摩爾比值等定量分析。HPLC方法操作相對較復雜，需經過衍生化后才能進行檢測，但方法靈敏度高，分析單糖組成復雜的多糖其結果更加準確、可靠，同時可用于單糖摩爾比值等定量分析。

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（收稿日期：2016-07-20 本文編輯：趙魯楓）